基因克隆详细步骤说明书

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1、实验一大肠杆菌感受态细胞的制备及转化[实验原理]（供参考，试剂盒的SolutionSS成分未知）细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。其原理是：在0℃下的CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形。转化缓冲液中的DNA形成不易被DNA酶所降解的羟基—钙磷酸复合物，此复合物粘附于细菌细胞表面。42℃短时间热处理（热休克），可以促进细胞吸收DNA复合物。将处理后的细菌放置在非选择性培养液中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型(如Amp抗性)得到表达。然后再涂布于含有氨苄青霉素的选择性平板上，37℃培养过夜，这样即可得到转化菌落

2、。[仪器、材料与试剂](一)仪器1．小型高速离心机2．恒温摇床3．恒温箱4．‐20℃冰箱5．恒温水浴器(二)材料1．氨苄青霉素2．大肠杆菌DH5a3．pUC194．1.5mL离心管5．枪头、枪6．试管、培养皿(三)试剂1．快速感受态细菌制备试剂盒（申能博彩公司产品）2．LB培养液在950mL去离子水中加入：胰蛋白胨(tryptone)10g酵母提取物(yeastextract)5gNaCl10g摇动容器直至溶质完全溶解，用Na0H调节pH至7.0，加入去离子水至总体积为1L，121℃湿热灭菌20min。3．氨苄青霉素(Amp)，用无菌水配制成100mg／mL溶液，置‐20℃冰箱保存。[实验

3、步骤]1．从大肠杆菌DH5a平板上挑取一个单菌落接于2mLLB培养液的试管中，37℃振荡培养过夜。2．取50mL菌液转接到一个含有5mLLB培养液锥形瓶中，37℃振荡培养2小时。以下步骤按修改后的试剂盒说明书进行。3．用灭菌的枪头取0.5mL的大肠杆菌培养物于1.5mL灭菌离心管中，冰上放置3分钟后，加入0.5mL预冷的SolutionSS。在冰上小心地用1mL枪头将细胞悬浮起来。注意：1mL的取液器设定在500mL。悬浮细胞要轻，防止细胞进入枪内。4．将上述细胞分装于1.5mL离心管(离心管要在放在冰上预冷)中，每管0.1mL。细胞可以立即使用或储存。5．将感受态细胞迅速转移到‐20℃或

4、更低的低温冰中。注意：在转移过程中要防止温度升高，解决的办法之一是在塑料袋里装上低温冰块，将细胞迅速转移到塑料里，将整个塑料袋放到低温冰箱内。转化：1．新鲜制备的或‐20℃下保存的100mL感受态细胞，置于冰上，完全解冰后轻轻地将细胞均匀悬浮。2．加入5mLpUC19质粒，DNA浓度为10pg/mL，轻轻混匀。3．冰上放置30分钟。4．42℃水浴热激60秒。5．冰上放置2分钟。6．加400mLLB培养液，37℃250转／分振荡培养30分钟。7．室温下4000rpm离心5分钟，用枪头吸掉400mL上清液，用剩余的培养液将细胞悬浮。8．将细菌涂布在Amp/LB琼脂平板上。9．平皿在37℃下正向

5、放置1小时，待接种的液体吸收进琼脂后，将平皿倒置，培养过夜。[实验结果]经37℃培养过夜的、在氨苄青霉素/LB琼脂平板上出现的菌落即为pUC19质粒转化的大肠杆菌。计数菌落总数，计算制备的感受态菌的转化效率，以每mg质粒DNA转化的菌落数表示。实验二质粒DNA的提取[实验原理]碱裂解法提取质粒利用的是共价闭合环状质粒DNA与线状的染色体DNA片段在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0‐12.5这个狭窄的范围内，线状的DNA双螺旋结构解开变性，在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键虽然断裂，但两条互补链彼此依然相互盘绕而紧密地结合在一起。当加入pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液使pH降

6、低后，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链迅速而准确地复性，而线状的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，不能迅速而准确地复性，它们缠绕形成网状结构。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质‐SDS复合物等一起沉淀下来，而质粒DNA却留在上清液中。[仪器、材料与试剂](一)仪器1．恒温培养箱2．恒温摇床3．小型高速离心机4．高压灭菌锅(二)材料1．带有pQE‐31质粒和pUC18‐CAT质粒的两株大肠杆菌2．1.5mL离心管3．枪头、枪(三)试剂质粒小量制备试剂盒(3SSpinplasmidMIniprepKitV3.1,申能博彩公司)试剂盒的参考配方:SolutionI50

7、mmo1／L葡萄糖，5mmo1／L三羟甲基氨基甲烷(Tris)Tris·HCl(pH8.0)，1.0mmo1／L乙二胺四乙酸(EDTA)(pH8.0)，SolutionII0.4mo1／LNa0H，2％SDS(十二烷基硫酸钠)，用前等体积混合SolutionIII5mo1／L醋酸钾，60mL冰乙酸11.5mL水，28.5mLTE缓冲液，10mmo1／LTris·HCl1mmo1／LEDTA(pH8.0)，胰RNA酶(RN