基因组DNA抽提操作流程.doc

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1、基因组DNA抽提操作流程一、原理与意义先用细胞裂解液对已制备好的组织匀浆充分裂解，然后用蛋白酶去除其中的蛋白，再用氯仿一次抽提（无需用酚抽提）、预备液沉淀、RNase去除RNA、乙醇再沉淀即可得到完整DNA。该方法适用于从人或动物的各种组织、血液、培养细胞、G+/G－细菌中快速抽提基因组DNA。抽提出来的DNA能用于几乎所有的分子生物学实验，如DNA梯度分析、PCR、限制性内切酶反应、克隆、SouthernBlot分析等。二、试剂及其配制抽提试剂盒购于上海生工公司，内含以下试剂：1.TE缓冲液：PH8.0，由10mMTrisHCl

2、和1mMEDTA配成。2.RNaseA（3mg）：使用前加入300µl无菌双蒸水，煮沸10min后使其自然冷却后使用，-20℃冻存。3.ProteinaseK（12mg）：使用前加入600µl无菌水，分装成小份，-20℃冻存。4.CellLysisSolution与PrecipitationSolution：溶液出现絮状沉淀50℃加热溶解后使用。5.1.2mol/LNaCl。冰冷乙醇和氯仿自备。三、实验器材水浴锅、普通冰箱、1.5/2ml离心管、移液器及枪头、紫外分光计、离心管架、剪刀、镊子、滤纸等。四、操作步骤1.组织匀浆制备：

3、取30mg左右新鲜组织，加600mlTE缓冲液，手工匀浆数次。2.细胞裂解：吸取300µl匀浆加600µlCellLysisSolution，混匀。3.消化蛋白：再加入9µlProteinaseK(可适当增加)混匀，置于55℃水浴30min以上（可达2.5h），其间上下混匀几次。4.氯仿抽提：加入600µl氯仿（用户自备），轻柔上下混匀，不能太剧烈，以保证DNA的完整性。5.沉淀：在台式离心机上，10000转/分，室温离心2min。此时应分成三层，基因组DNA在上层中，如未能分层，表明样品与氯仿未混匀（可通过延长离心时间或增加离心

4、速度获得上清）。取500µl上清液，置于无菌1.5ml离心管中，加入500µlPrecipitationSolution，混匀多次至出现絮状物，室温静置2min。10000转/分，离心2min。6.去除RNA：弃除上清，注意不要倒掉沉淀，立即加入100µl1.2mol/LNaCl，轻轻振荡直至DNA样品完全溶解，加入3µlRNaseA，置于37℃10min，以去除RNA。7.沉淀DNA：加入300µl冰冷乙醇（终浓度为75％，沉淀效果最佳），－20℃放置10min。10,000转/分，离心2min。倒掉乙醇，倒置室温干燥10～15

5、min。若DNA量多，可再重复沉淀一次。DNA用TE缓冲液或100µl三蒸水溶解。二、注意事项1.应避免多次冻融样品，因为每次冻融都大大降低完整DNA的产率。2.加氯仿充分混匀，若离心后上清不到500ml，可适当延长离心时间或增加离心速度。3.吸取DNA上清时，可用剪刀稍剪枪头尖部，以防止虹吸现象。4.操作步骤中许多数值可进行成比例改变，如上清与预备液按1:1，氯化钠与无水乙醇按1:3等。1.转录活性很高的组织或细菌中通常含有大量的RNA，他们可能与DNA一起被分离出来。RNA的存在并不影响PCR反应。如果需要制备RNA-free

6、的基因组DNA。可在第6步加入200µl的RNaseA，37℃保温10min即可。2.用分光光度计测量DNA含量按1OD260=50mg基因组DNA；进行0.7%琼脂糖凝胶电泳判定DNA的完整性，也可以判定样品中是否有RNA。本试剂盒可抽提长抵达50kb以上的DNA。一般在DNA样品中，OD260/OD280比值大于1.8，可能存在RNA；OD260/OD280比值小于1.6，可能存在蛋白质或酚。但RNA样品中OD260/OD280比值小于2可能存在蛋白质或酚，均需要进一步纯化。3.通常50µl体系PCR反应中用1～5µlDNA。