DNA抽提标准化操作规程

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1、DNA抽提标准化操作规程1目的：DNA抽提标准化操作规范适用于HLA试验中的DNA抽提操作。2适用范围：DNA抽提实验室3依据：DNA抽提标准化操作规范4引用文件：德国BAG公司（以下简称BAG）《InstructionsforuseEXTRA-GENEI》5程序5.1试剂准备5.1.1BAG®EXTRA-GENEI该试剂盒包括3部分：Solution1、Solution2、Solution3使用前，若Solution2有沉淀请将其在37℃孵育，直至沉淀完全溶解5.1.2乙醇溶液，浓度（V/V）为96%或100％5.1.3乙醇溶液，浓度（V/V）为70%5.1.4灭菌蒸馏水

2、，按照灭菌蒸馏水配制标准操作规范5.2仪器及用具准备5.2.1移液器，规格：20µl–200µl、200µl–1000µl5.2.2移液器配套吸头，规格：200µl和1000µl，灭菌、无DNA/RNA残留5.2.3Eppendorf离心管，规格：1.5mL或2.0mL，灭菌5.2.4混匀器5.2.5离心机（至少13，000rpm，）5.2.6水浴箱5.2.74DNA浓度测定仪（DNA单位为ng/µl，可提供A260/280）5.2.8试管架（每排24孔）5.2.9手套规格：乳胶手套，与操作者手形相

3、适应，经灭菌5.3操作步骤：5.3.1换工作服、戴手套5.3.1.1从工作服衣柜中换取专用工作服，戴上适应自己手形的乳胶手套。5.3.2血样检查5.3.2.1血样应在-20℃保存，保存时间不应超过1年，无溶血、血样保存容器无破裂、无渗漏、容器盖子无松动等现象。5.3.2.2核对血样记录与捐献者记录，确定血样是否有效，只有有效捐献者记录的血样才能用于试验。5.3.2.3血样量至少1mL。5.3.2.4选取满足以上要求的24个血样作为一组抽提标本。5.3.2.5若血样本是冻存的，请将血样在室温下孵育至其完全解冻。5.3.3DNA抽提5.3.3.1将选取的24个血样按照编号的顺序依次放置

4、在试管架上，每排12个，共2排。在记录本上按顺序记录样品号、抽提日期、抽提者等。5.3.3.2取24个1.5mLEppendorf离心管，依次放置在试管架上，每排12个，共2排，与血样一一对应，并在离心管上用油性记号笔标上对应血样的号码。5.3.3.3向每个离心管中加入500µl--600µlEDTA或柠檬酸抗凝血（新鲜或冻存），要求抗凝血充分混匀，不见固体悬浮物。用加样器反复吹吸血液，注意吸取血液时要求缓缓吸入，不要过快，以免血液进入加样器中，污染加样器。取900µlSolution1加入到每管中，盖紧离心管盖子（要防止手套污染盖子内壁），充分

5、混匀混合液，不见固体悬浮物。8000rpm4离心1分钟，从离心机中取出离心管，依血样顺序放置离心管于试管架上。5.3.3.4小心倒去上清液，弃之，注意不要将沉淀倒出，离心管口向下倒置在吸水纸上5秒钟，使剩余液体流出。5.3.5向每管中加入1000µlSolution1,振荡混匀，使细胞沉淀打散悬浮，放置1—2分钟。8000rpm离心1分钟。小心倒去上清液，如同5.3.3.。5.3.3.6此时管中沉淀应为灰白色，如果细胞沉淀仍为红色，需重复5.3.3.5。5.3.3.7每管加入240µl蒸馏水，振荡混匀，务必使细胞沉淀完全打散悬浮；再加入120µl

6、Solution2,用混匀器充分混匀，直至沉淀完全溶解。每管加入120µlSolution3,反复颠倒离心管，室温下孵育5--10分钟（可以适当延长孵育时间），孵育时偶尔摇匀反应管，直至产生白色絮状。13000rpm离心5分钟，重新取24个1.5mL离心管，并依次标上对应的血样号码，依次放置在试管架上。5.3.3.8小心将含有可溶性DNA的上清液转倒入对应样本号的空离心管中，不要搅动沉淀；每管再加入120µlSolution3，反复颠倒离心管，室温下孵育5-10分钟，13000rpm离心5分钟。5.3.3.9重新取24个1.5mL离心管，并依次标上对应的样本

7、号码，依次放置在试管架上。小心将含有可溶性DNA的上清液转倒入对应样本号的空离心管中，不要搅动沉淀。5.3.3.10向每管加入1ml96％乙醇，轻轻上下翻转离心管以混合均匀，室温放置5分钟，可见到白色絮状DNA沉淀。13000rpm离心2分钟。5.3.3.11小心弃去上清液，注意不要倒掉DNA沉淀，将离心管口向下倒置在吸附物上，使剩余乙醇流出。再向每管中加入1ml70%乙醇，反复倒置离心管。13000离心2分钟。5.3.3.12小心弃去上清液，注意不要倒掉DNA沉淀。