氟代苯硼酸与单糖间结合规律探究.doc

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1、氟代苯硼酸与单糖间结合规律探究摘要取代硼酸与顺式二軽皋化合物间的相互作用是设计亲和配基、功能材料和传感元件以分离、富集和识别顺式二轻基化合物的重要基础。氟代苯硼酸在较低pH条件下具有较高的硼亲和力，但其与单糖间的相互作用规律目前尚未得到阐明。本研究以亲和毛细管电泳为相互作用表征手段，研究了9种不同结构的氟代苯硼酸与3种典型单糖（甘露糖、果糖和葡萄糖）在不同pH条件下的结合常数。同时，利用紫外分光光度法测量了这9种氟代苯硼酸的酸度系数。经过结构-性能关联，对氟代苯硼酸与甘露糖、果糖和葡萄糖的结合规律以及对葡萄糖的选择性进行了探讨。关键词氟代苯硼酸；单糖；相互作用；亲和

2、毛细管电泳1引言取代硼酸分子对顺式二耗基结构具有特异性识别作用，被广泛应用于糖、糖蛋口、修饰核苜、RNA等生物分子传感［1〜4］和分离富集［5〜8］研究中，近年来在亲和分离［9〜14］、蛋白质组学［15〜19］、代谢组学［20〜23］、疾病诊断［24〜27］以及固相标记［28］方面得到了越来越多的重要应用。生物样品多为酸性到偏碱性，而且其中含有的顺式二轻基生物分子的丰度低，因硼酸酚基的适用pH范围宽、亲和力高，在生物学研究屮应用广泛。研究取代硼酸与单糖分子间相互作用规律，对于选择合适配基具有重要指导意义。由于氟原子的特殊结构和电子效应，氟取代被广泛用于药物设计、功能

3、材料等领域中的分子改性，起到增强分子代谢稳定性、改变官能团理化性质和稳定分子构象等作用[29,30]oYan等[31]考察了卤索取代对硼亲和力的影响，结果表明，氟取代的苯硼酸的亲和力比氯取代和漠取代的高得多。本研究组在前期工作屮发现，氟取代能增强苯硼酸在低pH条件下的亲和力[32]o然而，氟取代的位置和数目对苯硼酸的亲和力影响，目前未见文献报道。因此，深入研究氟取代苯硼酸的性质及其与顺式二疑基分子间的相互作用规律具有重要意义。亲和毛细管电泳(Affinitycapi11aryelectrophoresis,ACE)是一种基于被分析物结合前后电泳淌度的变化，表征分子间

4、相互作用的毛细管电泳方法，具有准确度高、重现性好、快速、高通量及操作简便等优点[33]oACE已被证明是表征取代硼酸与含顺式二超基生物分子间相互作用的可靠手段[32]o本研究选择3种典型单糖(甘露糖、果糖和葡萄糖)及9种氟代苯硼酸为研究对象，利用ACE考察它们间的相互作用，通过结构-性能关系，分析了氟代苯硼酸与单糖间相互作用与分了结构间的关系规律。硼酸探针分子检测血液中葡萄糖时，果糖为主要干扰物，本研究考察了氟取代苯硼酸对葡萄糖/果糖的选择性。2实验部分2.1仪器与试剂2-氟苯硼酸(2-FPBA)、3-氟苯硼酸(3-FPBA)>4-氟苯硼酸(4-FPBA)、2,3-

5、二氟苯硼酸(2,3-DFPBA)、2,4-二氟苯硼酸(2,4-DFPBA)、2,5-二氟苯硼酸(2,5-DFPBA)、2,6-二氟苯硼酸(2,6-DFPBA)、3,5-二氟苯硼酸（3,5-DFPBA）.2-（三氟甲基）苯硼酸（2-TFPBA）,均购自百灵威公司，纯度大于97%；苯硼酸和二甲亚飒（DMSO,分析纯，上海国药集团）；D-甘露糖（纯度为99%,AlfaAesar公司）；D-果糖（上海惠兴试剂公司）。以上试剂均未经处理直接使用。实验用水为Mill!Q超纯水（Millipore公司），所有溶液使用前用0.45Pm滤膜过滤。ACE实验在P/ACEMDQ系统（美国

6、BeckmanCoulter公司）上进行。实验用毛细管（河北永年锐泮色谱器件有限公司）规格为60cmX50umi.d.（50cm至检测器）。若无特殊说明，ACE实验是在25°C下进行，分离电压为24kV,二极管阵列检测器检测。每次电泳实验前，依次使用0.1mol/LNaOH溶液在137.9kPa条件下冲洗2min,运行缓冲溶液冲洗2min0进样采用3.447kPa,5soNanodrop-2000C微量紫外可见分光光度计（美国Thermo公司）。2.2实验方法2.2.1亲和毛细管电泳原理硼酸配基（T）与单糖分子（L）通常以1：1的化学计量比反应，反应式和结合常数（心

7、）如式（1）所示：当单糖分子对于硼酸分子大大过量时，式（4）中的［Lf］可使用单糖浓度代替。（vUi-Pf）是实测的氟代硼酸分子的淌度变化值，而（》b-Uf）是硼酸分子与单糖完全结合后与未结合硼酸分子间的淌度差值，对于给定硼酸-糖体系为常数。通过改变运行缓冲溶液中的单糖浓度，可以获得一系列硼酸分子淌度变化值与单糖浓度间关系的数据，根据式（4）,用双曲线方程进行数据拟合，获得结合常数Ka的值。2.2.2亲和毛细管电泳实验方法电泳运行缓冲溶液为添加不同浓度单糖分子的50mmol/L磷酸盐缓冲溶液(PBS,pH6.0,7.0或8.0),样品使用含有0.1%DMSO的单