贵州少数民族酸肉、酸鱼中乳酸菌的分离鉴定.doc

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1、贵州少数民族酸肉、酸鱼中乳酸菌的分离鉴定摘要：采用传统微生物分离方法进行乳酸菌纯种分离，利用16SrRNA序列分析方法进行乳酸菌鉴定，从7个酸肉、酸鱼样品中共分离出14株乳酸菌，有乳杆菌属、环丝菌属、乳球菌属3个属，9个种。从其中鉴定出7株乳酸菌,分别是：植物乳杆菌(Lactobacillusplanlarum)>消化乳杆菌(Lactobacillusalimentarius)>清酒乳杆菌(Lactobacillussakei)>泡菜乳杆菌(Lactobacilluskimchi)>清酒乳杆菌亚种(肉)

2、(Lactobaci1lussakeisubsp.carnosus)>草孚二杆菌(Lactobaci1lusgraminis)>弯曲乳杆菌(Lactobacilluscurvatus)o关键词：酸鱼；酸肉；乳酸菌；分离鉴定中图分类号：TS214.2文献标志码：A文章编号:1001-8123(2013)07-0040-04贵州黔东南苗族、侗族自治州传统发酵酸肉/鱼制品主要是以猪肉和鱼肉为原料，洗净后加入一定量的盐腌制2〜3d,再根据当地的饮食习惯多加甜酒、熟糯米、生姜、花椒、辣椒粉、大蒜等辅料，装入坛、瓦

3、缸、木桶等容器中，上层用叶片、塑料和水来隔绝空气，放置于避光阴凉地方自然发酵。此方法是当地居民延续祖先智慧结晶一代一代传承下来的，具有历史悠久、风味独特、安全和绿色的特点。但由于传统手工工艺制作，发酵时间长，没有大规模的生产和市场上流通，其他地域的人们无法享受这种风味独特的发酵肉制品[1-3]o乳酸菌是发酵肉制品中的优势菌群,对发酵产品的风味和营养品质变化起着至关重要的作用[4-7]o目前，对于贵州传统少数民族发酵肉制品中乳酸菌的研究还相当缺乏⑻。因此，本研究以贵州少数民族地区侗族发酵酸肉和苗族发酵酸鱼

4、为材料，采用传统微生物分离方法进行乳酸菌纯种分离，利用16SrRNA序列分析方法进行乳酸菌鉴定[9-12],旨在从原生态食品中发掘有益乳酸菌，以利于进一步研究乳酸菌的发酵特性、改进传统工艺，为保护、利用本土原生态的微生物资源打下基础。1材料与方法1.1材料与试剂1.1.1实验材料实验原料来自于贵州省黔东南州从江县及黎平县农户家纯手工制作的酸肉、酸鱼，共7个样品，其中酸肉4个样品，酸鱼3个样品，采样时严格按照国标GB/T4789.1—2010《食詁安全国家标准：食品微牛物学检验》操作。酸肉、酸鱼样品分别编

5、号如表1所示。1.1.2培养基及主要试剂培养基:MRS肉汤培养基、PY培养慕、PYG液体培养基（在PY培养基中添加10g/L葡萄糖）。主要试剂：革兰氏染色试剂、细菌微量牛化鉴定管（麦芽糖、乳糖、葡萄糖）、试剂A（a-蔡酚5g和95%体积分数乙醇100汕）、试剂B（KOH80g、肌酸（Creatine）0.6g＞蒸係水200mL）、溶菌酶、CTAB（十六烷基三甲漠化胺）裂解液、Tris-饱和酚、氯仿、异戊醇、聚乙二醇均为分析纯。1.2仪器与设备CX21SF1奥林巴斯生物显微镜奥林巴斯(中国)有限公司；S1

6、000TMThermalCyclerPCR仪、DcodeTMUniversalMutationDetectionSystemDGGE电泳仪、GelDocXR凝胶成像仪美国Bio-Rad公司；GilsonP型移液器法国吉尔森公司；Micro17R微量高速冷冻离心机美国ThermoElectron公司。1.3方法1.3.1菌株分离纯化取3g样品，剪碎放入MRS液体培养基中，36°C恒温厌氧培养48h,然后稀释5个梯度(10-1-10-5)后，直接涂布于MRS固体培养基上，36°C恒温厌氧培养48ho再采用平

7、板划线法对涂布平板中不同的单个菌落进行接种、培养，并进行革兰氏染色和镜检，重复分离纯化直至镜检结果一致。1.3.2菌株分类鉴定方法1.3.2.1菌落特征対纯化菌株在MRS固体培养基上的菌落特征进行观察、记录和编号，主要包括菌落大小、形状、颜色、湿润度、光泽度、透明度、隆起形状、边缘特征等。将初步认定为乳酸菌菌株进行革兰氏染色镜检。1.3.2.2菌种分类生理生化试验主要生理生化试验包括：接触酶试验、甲基红试验、乙酰甲基甲醇(voges-proskauer,V卩)试验、石蕊牛奶试验、淀粉水解试验、葡萄糖产酸

8、试验和糖发酵试验［13-15］o1.3.3菌株DNA的提取参照谭映月等［16］提取DNA方法，有所改动。取备用菌株菌液2汕于2mL离心管中，8000Xg离心8min,收集沉淀;力H200uL溶菌酶(质量浓度为0.05g/mL),置于35°C水浴2h；加2%十六烷基三甲基澳化鞍(Hexadecyltrimethylammoniumbromide,CTAB)裂解液0.5mL,上下颠倒混匀lOmin；加0.5mLTris-饱和酚：氯仿：异戊醇二2