培训课件：酶联免疫吸附试验(ELISA)操作注意事项.ppt

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1、酶联免疫吸附试验操作注意事项酶免疫测定类型这种固相酶免疫测定方法在1971年最初建立时称为酶联免疫吸附剂测定（EnzymeLinkedImmunoSorbentAssay），简称ELISA。酶免疫技术酶免疫组化酶免疫测定均相酶免疫测定非均相酶免疫测定固相酶免疫测定液相酶免疫测定ELISA原理（以一步法双抗体夹心法测抗原为例）ELISA其原理为抗原抗体特异性结合和抗原抗体的酶标记，以酶催化底物显色来判断结果。影响酶联免疫测定的因素较多,诸如标本的采集保存、试剂的准备、加样的技术、孵育温度的控制、洗涤反应板的方式、显色反应时间的控制等一系列问题均有可能对试验结果产生很大的影响

2、,只有避免了这些因素,才能保证试验结果的准确性和可靠性。一、移液枪的使用1.样品准备（1）吸样之前要保证移液枪、枪头和液体处于相同温度。置于冰箱保存的样品应提前取出，室温放置，使温度平衡后再吸样。液体温度>吸头温度的移取的液体体积会偏大液体温度<吸头温度的移取的液体体积会偏小（2）若溶剂瓶中液体太少，可倒入EP管中，方便吸取。2.体积设定大体积小体积逆时针精度最佳小体积大体积顺时针调至超过设定刻度，再回调可保证最佳的精确度严格的精确调节方法3.装枪头将移液枪端垂直插入吸头，左右微微转动，上紧即可上下敲击会引起内部的零部件因瞬间强烈撞击而松散，甚至会导致调节刻度的旋钮卡

3、住4.吸液（1）垂直吸液，枪头吸嘴尖端需浸入液面2-4mm以下。（2）枪头吸嘴预润湿（2-3次），使吸嘴内壁液体吸附达到饱和，再吸入样液，最后打出液体的体积会很精确。一般液体，正向吸液（一档二档）。粘稠液体和易挥发液体，可反相吸液（二档一档）。正向吸液反向吸液（3）缓慢吸取，控制好弹簧的伸缩速度。吸液速度太快会产生反冲和气泡，导致移液体积不准确和腐蚀枪体。（4）吸取后将移液枪提离液面，停约一秒钟，观察是否有液滴缓慢地流出。若有流出，说明有漏气现象（原因有：枪头未上紧；枪头不匹配；移液枪内部气密性不好）。（5）吸嘴外壁残留液滴可沿壁靠去或用滤纸蘸擦。5.放液（1）将吸嘴

4、口贴到容器内壁并保持10-40°倾斜。（2）平稳地把按钮压到一档，停约一秒钟二档，排出剩余液体。排放致密或粘稠液体时，压到一档后，再多等一两秒钟二档。（3）压住按钮，同时提起移液器，使吸嘴贴容器壁擦过。（4）松开按钮。（5）按弹射器除去移液嘴。（6）使用完毕。移液枪的养护及注意事项吸取液体时一定要缓慢平稳地松开拇指，绝不允许突然松开，以防溶液吸入过快而冲入枪体内腐蚀柱塞造成漏气。移液枪应轻拿轻放，不能将已吸有液体的移液枪平放或倒置，以免液体倒流腐蚀活塞弹簧。不得用移液枪移取有腐蚀性的溶液，如强酸、强碱等。如有液体进入枪体，应及时擦干。千万不要将按钮旋出量程，否则会卡住

5、内部机械装置而损坏移液枪。移液枪长时间不用时建议将刻度调至最大量程，让弹簧恢复原形，保持松弛状态，延长移液枪的使用寿命。应定期对移液枪进行校准。二、ELISA具体操作1标本的收集和保存2试剂的准备3加样本及反应试剂4温育5洗板6显色7比色8结果判断1标本的收集和保存样品必须置冰箱中冷冻保存。待检测时取出解冻待测。1标本的收集和保存（1）细菌生长所分泌的一些酶可能会对抗原抗体等蛋白产生分解作用；一些细菌的内源性酶可对以相应酶作标记的测定方法产生非特异性干扰。样品在保存中如出现细菌污染所致的混浊或絮状物时，应离心沉淀后取上清检测。（2）冰冻保存的样品须注意避免因停电等造成的反

6、复冻融。2试剂的准备试剂盒成分：常用的固相载体（ELISA板孔）材质：聚苯乙烯、聚氯乙烯，具有良好的吸附性能，孔底透明度高，空白值底，各板之间、同一板各孔之间性能相近。包被抗原或抗体与聚苯乙烯固相载体通过疏水基团作用物理吸附结合常用的酶：HRP，AP，葡萄糖氧化酶，β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。洗液：非离子型洗涤剂酶反应的底物：H2O2，为受氢体；显色剂：邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)和ABTS，为供氢体。终止液为硫酸。2试剂的准备（1）在实验开始前，将试剂盒先从冰箱中取出，在室温下放置30分钟以上，再进行测定，以使试剂盒在使用前与室温平衡。这样做的目的，主要是

7、为了缩短升温时间，使反应孔内的温度能较快地达到所要求的高度，以满足测定要求。（2）试剂盒中的洗涤液如需在使用时对所提供的浓缩液稀释配制，稀释时所用的蒸馏水或去离子水应保证质量。3加样本及反应试剂在ELISA实验中一般有3次加样步骤，即加样品、加酶结合物、加底物和显色剂。加样必须注意的关键点是：（1）加样不可太快，要避免加在孔壁上部，不可溅出和产生气泡。加样时如有气泡，抗原抗体不能有效地结合会导致弱阳性甚至假阴性。（2）每次加样品应更换吸头，以免发生交叉污染。（3）加酶结合物、加底物，应使加液量准确均一、加液过程迅速完成。也可使