葡萄糖调节蛋白GRP78在小梁网细胞中的表达及临床意义.doc

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1、葡萄糖调节蛋白GRP78在小梁网细胞中的表达及临床意义［摘要］目的检测葡萄糖调节蛋白78(GRP78)在体外培养的正常人小梁网细胞(NTM)及原发性开角型青光眼(POAG)患者小梁网细胞(GTM)中蛋白及mRNA表达差异及临床意义。方法将体外培养的NTM及GTM细胞分为衣霉素(Tm)组、十字鞄碱(STS)组及对照组，采用Real-timePCR、Westernblot方法检测药物处理6、24h后小梁网细胞中GRP78mRNA及蛋白表达。结果原代培养的GTM细胞中GRP78表达水平明显低于NTM细胞，差异有统计学意义(P1材料与方法1.1药品与试剂DMEM/F12培养基购于Gibc

2、o公司，胎牛血清购于杭州四季青公司，二甲基亚枫(dimethylsulfoxide,DMSO)、衣霉素(Tunicamycin,Tm)、十字胞碱(Staurosporine,STS)购于美国Sigma公司，逆转录试剂盒购于Fennentas公司,Westernblot检测试剂盒购于CellSignaling公司。1.2实验分组收集健康供体及青光眼患者小梁网组织进行原代培养并进行传代［9］。将第3代小梁网细胞接种于25cm2培养瓶底，DMEM-F12培养液(含质量分数15%胎牛血清，60mg/L青霉素，100mg/L链霉索）培养。将NTM、GTM细胞接种于培养瓶，待细胞完全融合后，

3、分别加入含有1Uinol/LTin培养液、0.1umol/LSTS培养液和不含上述任何药物的培养液，分为Tm组、STS组、对照组，每天换液，处理6〜24ho采用Real-timePCR>Westernblot方法检测药物处理6、24h后小梁网细胞中GRP78mRNA及蛋白的表达。1.3RNA提取和RT-PCR样品总RNA提取：培养瓶中加入Trizol,吹打后移入离心管，振荡器混匀。加入氯仿，混匀、静置分层后，离心转上清于另一离心管中，加等体积异丙醇，离心后弃上清，加预冷的75%乙醇，再次离心后弃上清，ddH20溶解沉淀。取RNA样品，检测RNA在230、260、280nm处的吸光

4、度，确定其质量、浓度；再进行琼脂糖电泳，检测RNA完整性；依Fermentas逆转录试剂盒程序进行逆转录。将上述逆转录所得DNA进行扩增，得到目的片段，从而在mRNA水平检测小梁网细胞GRP78的表达。采用DNA琼脂糖凝胶电泳，用四星图像分析系统对凝胶各泳道中的目的条带和内参条带进行光密度扫描，定量分析。实验重复3次。1.4Westernblot检测根据Westernblot检测试剂盒说明提取细胞膜蛋白进行10%聚丙烯酰氨凝胶电泳分离，依次将Maker、各蛋白样品加入梳孔内，Maker上样量为5uL,其余每孔上样量为20nL(含总蛋白30ug),电压为恒压200V,待澳酚兰指示剂

5、跑至分离胶下缘时，停止电泳，再经转膜、封闭，一抗、二抗封闭后进行曝光检测，最后再入定影液10min,清水漂洗，晾干。用四星图像分析系统对免疫印迹结果进行定量分析。1.5统计学方法应用SPSS16.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数土标准差(x±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；相关性分析用Pearson检验；以PGRP78位于真核生物细胞的内质网膜上，与热休克蛋白70(Hsp70)家族具有高度同源性，被认为是Hsp70家族的成员之一。GRP78的表达变化被认为是ERS未折叠蛋白质反应的标志；在低糖、低氧、低Ca2+等应激反应调节时其

6、基因的转录活性可提高10〜25倍，表达量显著增高，从而维持了内质网钙稳态及内环境的稳定。因此，近年来认为细胞受刺激时GRP78呈高表达并合成GRP78的反应，可能是细胞的一种重要防御机制，该机制对细胞有保护作用从而延长在各种不利因素刺激下的细胞生存期[18-20]o然而，本研究通过Real-timePCR、Westernblot检测在NTM细胞及GTM细胞内GRP78mRNA及蛋白的表达，结果显示各组小梁网细胞均有GRP78表达，GRP78在GTM细胞内的表达水平较NTM细胞表达水平低。Tm是细胞产生ERS的诱发因素。为了进一步证实GTM细胞内GRP78表达下调是由于细胞对ERS

7、反应能力低下，本研究给予Tm药物处理，结果显示：NTM、GTM细胞经Tm处理后,GRP78mRNA及蛋白质表达量显著增加；GTM细胞GRP78表达水平的增加量明显低于NTMo该结果表明NTM及GTM细胞在ERS刺激下均能产生相应的应激反应，然而，后者对ERS刺激的反应能力明显低于前者。STS以0.1umol/L的浓度培养细胞6〜24h,结果显示:NTM、GTM细胞内GRP78蛋白表达量均下调；GTM细胞GRP78表达下调明显大于NTMo以上结果提示，GTM细胞由于保护性GRP78