细菌种属的分子鉴定(课件).doc

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1、用16SrDNA方法鉴定细菌种属—、目的1.掌握16SrDNA对细菌进行分类的原理及方法；2.掌握DNA提取、PCR原理及方法、DNA片段冋收等实验操作。二、原理随着分了生物学的迅速发展，细菌的分类鉴定从传统的表型、生理生化分类进入到备种基因型分类水平，如(G+C)mol%、DNA杂交、rDNA扌旨纹图、质粒图谱和16SrDNA序列分析等。细菌屮包括有三种核糖体RNA,分别为5SrRNA、16SrRNA、23SrRNA,rRNA基因由保守区和可变区组成。16SrRNA对应于基因组DNA上的一段基因序列称为16SrDNA。5SrRNA虽易分析，但核甘酸太少，没有足够的遗传信息用于分类研

2、究；23SrRNA含有的核廿酸数几乎是16SrRNA的两倍，分析较困难。而16SrRNA相对分子量适屮，又具有保守性和存在的普遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高，因此,现在一般普遍采用16SrRNA作为序列分析对象对微生物进行测序分析。利用16SrDNA鉴定细菌的技术路线：三、操作步骤(-)细菌基因组DNA提左1.挑单菌落接种到10mLLB培养基屮37°C振荡过夜培养。2.取2mL培养液到2mLEppendorf管屮，8000rpm离心2分钟示倒掉上清液。3.加140J1LTE打散细菌，再加入60

3、1L10mg/ml的溶菌酶。37°C放置10分钟。4.加入40

4、0gLDigestionBuffer,混匀。再加入3piLProteinK,混匀，55°C温育5分钟。5.加入260

5、1L乙醇，混匀，全部转入UNIQ-10柱屮。10000rpm离心1分钟，倒去收集管内的液体。1.加入500

6、1L70%乙醇(WashSolution),10000rpm离心0.5分钟。2.重复第六步。&再10000rpm离心2分钟彻底甩干乙醉。吸附柱转移到一个新的1.5mL的离心管。9.加入50yL预热（60°C）的洗脱缓冲液，室温放置3分钟。12000rpm离心2分钟，流下的液体即为基因组DNAo10.电泳。取3

7、iL溶液电泳检测质量。（二）PCR扩增1.根据已发表

8、的16SrDNA序列设计保守的扩增引物。16S（F）5,-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3,16S（R）5,-GGTTACCTTGTTACGACTT-3,2.PCR扩增体系：在0.2mLEppendorf管屮加入lpLDNA,再加入以「卜反应混合液:16S(F)l

9、iL(10gM)16S(R)lOxPCRBufferl

10、iL(10pM)5gLdNTP4

11、iLTaq酶0.5pL加ddH2O使反应体系调至50pL,简单离心混匀。3.PCR反应将Eppendorf管放入PCR仪，盖好盖子，调好扩增条件。扩增条件为:94°C3min94°C30secj50°C45secr35cy

12、cles72°C100sec72°C7min4.PCR产物的电泳检测拿出Eppendorf管，从屮取出5pL反应产物，加入lyL上样缓冲液，混匀。点入预先制备好的1%的琼脂糖凝胶中。电泳lhr。在紫外灯下检测扩增结果。（三）扩增片段的回收根据上步实验结果，如果扩增产物为唯一条带，可直接冋收产物。否则从琼脂糖凝胶屮切割核酸条带，并冋收目的片段。1）称量一2mL.的Eppendorf管质量，记录。2）在紫外灯下切割含日的条带的凝胶，放入2mL的Eppendorf管内，称量。计算凝胶质量。3）每100mg凝胶加入100gLBindingBuffer,混匀。60°C温疗至凝胶融化4）全部转入

13、UNIQ-10柱屮。10000rpm离心1分钟，倒去收集管内的液体。5）加入500pLBindingBuffer,10000rpm离心1分钟，倒去收集管内的液体。6）加入70%乙醇（WashSolution）,10000rpm离心0.5分钟。7）再10000rpm离心2分钟彻底甩干乙醉。吸附柱转移到一个新的1.5ml的离心管。8）加入30pL预热的洗脱缓冲液，室温放置3分钟。12000rpm离心2分钟，流下的液体即为冋收的DNA片段。）DNA片段測序将冋收的片段送至生物公司测序，测序引物为16SPCR引物。四、实验结果及分析1.根据测序结果，到NCBI上进行比对，确定该未知菌的种属。

14、2.根据比对结果进行进化树的绘制。写明所用软件及大致的分析方法。3.分析讨论实验的过程及结果。