菌种及可疑菌种鉴定SOP1.doc

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1、1.目的22.范围23.定义24.职责25.引用标准26•材料27.流程图28.内容29.注意事项410.EHS411・派生记录412.相关文件413.变更历史41.目的保证菌种的纯度和试验结果的准确性。2.范围本规程适用于微生物检验用到的菌种和实验中的可疑菌。3.定义N/A4.职责4.1.4.2.4.3.4.4.5.引用标准5.1.《药品生产质量管理规范》（2010年修订）卫生部第79令6.材料N/A7.流程图N/A&内容菌种的鉴定从药检所购冋的菌种首先从形态特征进行初步鉴定。然后挑取典型的菌落，进行革兰染色、镜检，观察其染色特性及菌种形态。并填写《菌种鉴定记录》。可疑菌的鉴别

2、分离、纯化无菌操作用接种环挑取待鉴定菌落或少许含菌液到相应的培养基上划线分离，培养时间为18〜24小时；或多数在培养基上划线分离以得到纯化的单一菌落。确定待鉴定菌的革兰氏屈性。挑取纯化的单一菌落做革兰氏染色、镜检。革兰氏染色823.1・染色试剂结晶紫溶液、碘溶液、脱色溶液、沙黄（蕃红）溶液、灭菌纯化水；也可以使用革兰氏染色套装试液。染色原理•革兰氏染色法可将所有细菌分为两大类：革兰氏阳件细菌和革兰氏阴性细菌G：细菌对于革兰氏染色的不同反应是由于它们细胞壁的成份和结构不同而造成的。•革兰氏阳性细菌G+：其细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程屮，当用结晶紫溶液染色细胞

3、后用脱色剂脱色时，引起细胞壁肽聚糖糖层网状结构小的孔径缩小以至关闭，通透性降低，使结晶紫一碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此呈现深紫色。•革兰氏阴性细菌G）其细胞嘩中肽聚糖含量低而脂类物质含量高，当用乙醇脱色时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫一碘复合物易被乙醇抽岀而脱色，继而乂被复染液着色，因此呈现红色。染色过程•在载玻片上滴上一滴灭菌纯化水，用无菌接种坏挑取一菌落均匀涂开，涂布不宜太厚或太薄，以免影响染色效果。•将载玻片涂片口然风干或在酒精灯火焰上方快速來回2〜3次微热使Z干燥、固定。载玻片以不烫手为宜，过热可能会影响染色效果。•涂片冷却后，滴加1〜2滴结晶紫溶

4、液，保留约1分钟后用冷水快速冲掉载玻片表面多余结晶紫溶液。•滴加1~2滴碘液，保留约1分钟后用冷水冲去碘液，再用脱色溶液脱色至流出的酒精刚刚不出现紫色为止（约20〜30秒），立即用冷水迅速冲净脱色酒•甩去多余水滴，滴加沙黄染液复染，保留约1分钟后用冷水冲去沙黄染液，用滤纸吸干载玻片背部水份，将载玻片置空气中晾干。•取金黄色葡萄球菌制成细菌涂片，染色后作为阳性对照；取人肠埃希菌制成细菌涂片，染色后作为阴性对照。8.2.34镜检在载玻片的菌膜上滴一•滴香柏油，用显微镜的油镜观察标本。菌体呈红色为革兰氏阴性菌，菌体呈蓝紫色为革兰氏阳性菌。同时观察菌体的状态、排列，分辩并描述是球菌、杆菌

5、、弧菌、放线菌以及菌体大小。革兰氏阴性杆菌氧化酶试验用滤纸沾取少许菌苔，滴加氧化酶试剂（TMPD）1滴，立即观察菌苔的颜色变化，若变成紫色或深紫色，为氧化酶+；不变色，为氧化酶再滴1滴氧化酶试剂在没冇沾取菌苔的滤纸做阴性对照，应不变色。革兰氏阳性球菌与革兰氏阳性杆菌825.1・触酶试验•用3%H2O2直接滴加到菌落上或菌悬液里，产生气泡，就是触酶+；不产生气泡，触酶・。•自配的3%H2O2溶液，不得加到生长血琼脂平板的菌落上，可能会产生假阳性结果。•不能用钠金类或鎳合金类的接种针或接种环去混合培养物和3%出。2溶液，可能会产生假阳性，在实验中，应用木质无菌牙签或塑料无菌接种环。菌

6、种的传代每次都应按以上程序对菌种进行鉴定，以保证菌种的纯度。当微生物检查牛长菌可疑或微牛物牛长异常，都应对这些菌进行鉴定。试验完后，所冇用的器具、试验条按《实验室废弃物处理SOP》处理。9.注意事项做好防护工作，以免被微生物感染。10・EHSN/A11・派生记录12.相关文件12.1.12.2.13・变更历史版本号修订号修订内容修订原因0100新文件无