微生物的分离与培养.doc

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1、微生物的分离与培养实验原理：一、培养基的制备培养基通过人工加入微生物的生长所必需的各种成分，包括水，碳源，单元，无机盐和生长因子各种营养物质配置而成的养料。二、微生物的接种微生物接种技术是生物科学研究中最基本的操作技术。由于实验目的，培养基种类及容器等不同，所以接种方法不同。用不同的接种方法以获得生长良好的纯种微生物。三、微生物的培养不同的微生物对营养需求不同，根据这点可以通过培养基对微生物的做初步分离。四、质粒的提取碱变性提取质粒DNA是基于染色体DNA和质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的的。在PH值高达12.6

2、的碱性条件下，染色体DNA的氢键断链，双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的大部分氢键也断链，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以PH4.8D的NaAc高盐缓冲液冲击去调节其PH值至屮性时，变性的质粒DNA乂恢复原来的构型，保存在溶液小，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA,蛋白质一SDS的复合物等一起沉淀下来而被除去。五、PCR技术DNA的半保留复制时生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋或单链°在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配

3、对原则复制或同样的两分子拷贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后可以复性成为双链。因此,通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶，dNTP就可以完成特定基因的体外复制。六、琼脂糖凝胶电泳许多重要的生物，如蛋白质，核酸等都具有可电离的基因，在某一特定的PH下他们可以电离正电荷或负电荷，当加上电均后，这些带点分子就会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。而电泳技术就是利用在电均的作用下，由于待分离样品中各种分子带点性质，分子大小形状等的差异，从而产生不同的迁就率，对样品进行分离

4、，鉴定或纯化的技术。PCR产物的回收将含有质粒DNA的荧光色带切下，溶解后填充到硅胶柱中，利用硅胶在高盐低PH下吸附DNA,在低盐和高卩H条件下DNA可在被洗脱的原理，进行DNA的回收和纯化。七、酶切限制性核酸内切酶是一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶（水解磷酸二酯键）。八、重叠延伸PCR技术（引物摒接PCR）重叠延伸卩CR技术由于采用有互补末端的引物，使卩CR产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠摒接起来，重叠PCR技术关键是重叠互补引物的设计，重叠延伸PCR在基因

5、的定点突变，融合基因的构建，长片段基因的合成，基因敲除以及目的基因的扩增方而有其广泛而特殊的应用o实验流程1：培养基的制备1.1药品的称量：在电子天平上按照配方称取蛋白腺（5g）NaCI（2.5g）牛肉膏（1.5g）琼脂（4g）1.2溶解加热与调解PH值:水浴加热至溶解，并用纯水定容至500ml,滴加lmol/L的NaOH滴定PH值为7.0〜7.51.3分装与灭菌：对三角烧瓶分别编号为A、B并依次加入250ml培养液，在B中加入预先称好的4g琼脂1.4固体培养基抗性的加入与倒平板：按照1/1000的剂量在三角烧瓶B中加入2

6、.5川的卡那霉素，摇匀后打开培养1111倒入较小的培养1111•备注：为防止培养基在凝固过程中冷凝水回流造成培养基污染，注意培养1111放置时上下而问题。同时，所有操作均在酒精灯附完成。2：大肠杆菌的接种与培养2.1微生物的接种：将完成灭菌的接种针沾取适量菌液，在已经凝固的培养基上如图3.2进行平板划线，注意：划线目的是在于将菌液转移到培养基上2.2微生物的培养：将完成接种培养基放入设定温度为37°C的牛化培养箱中过夜培养•备注：抗生素拥有半衰期，注意在半衰期中完成培养。同时所有操作均在酒精灯附完成。三角烧瓶等仪器打开和关

7、闭时注意瓶口通过火焰。3：质粒的提取3.1试剂盒的准备:将RNA酶加入S1中，去80ml无水乙醇加入到W2中3.2质粒提取:去2ml菌液于2ml的离心管中,8000rpm/min离心2min,弃上清液,重复以上操作一次，保证细菌沉积量。加入250川S1充分摇匀，使细菌悬浮。对准管壁，打入250glS2,为防止基因组和质粒一起被提取出来，温和翻转5次,静置Imino加入约350（11S3,充分混匀后冰上放置约1Omino12000rmp/min离心lOmin,并将上清液转移至制备管中静置Imino12000rmp/min离心

8、lmin,弃滤液。在制备管中央打入500

9、ilWl,12000rmp/min离心lmin,弃滤液。加入700j.ilW2,12000rmp/min离心lmin,重复2次。弃滤液后12000rmp/min离心空甩lmin,去除残余W2.制备管中央打入100plElunt静置lmin,12000rmp/mi