微生物的纯种分离与培养技术

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1、微生物实验技术第二章微生物的纯种分离及培养技术微生物的纯种分离及培养技术实验2-1土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化实验2-2化能自养微生物的分离与纯化实验2-3从沼液中分离产甲烷细菌实验2-1土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化一、实验目的1.学习、掌握从土壤稀释分离、划线分离各类微生物的技术。2.学习从样品中分离、纯化出所需菌株。3.学习并掌握平板倾注法和斜面接种技术，了解培养细菌、放线菌、酵母菌及霉菌四大类微生物的培养条件和培养时间。4.学习平板菌落计数法。实验2-1土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化二、实验原理将待分离的样品进行一定

2、的稀释，使微生物的细胞（或孢子）尽量呈分散状态，选用有针对性的培养基，在不同温度、通风等条件下培养，让其长成一个纯种单个菌落。要想获得某种微生物的纯培养，还需提供有利于该微生物生长繁殖的最适培养基及培养条件。微生物四大类菌的分离培养基、培养温度、培养时间见表2-1所示。实验2-1土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化表2-1微生物四大类菌的分离和培养要求样品来源分离对象分离方法稀释度培养基名称培养温度/℃培养时间/d土样细菌稀释分离10-5，10-6，10-7牛肉膏蛋白胨30～371～2土样放线菌稀释分离10-3，10-4，10-5高氏1号285～7土样霉菌稀释分

3、离10-2，10-3，10-4马丁氏琼脂28～303～5面肥或土样酵母菌稀释分离10-4，10-5，10-6马铃薯葡萄糖28～302～3细菌分离平板细菌单菌落划线分离10-2牛肉膏蛋白胨30～371～2实验2-1土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化三、实验材料1.菌源土样2.培养基牛肉膏蛋白胨培养基，马丁氏培养基，高氏合成1号培养基，马铃薯葡萄糖培养基(制平板和斜面)，见附录Ⅲ。3.无菌水250mL锥形瓶，每瓶装99mL无菌水(或95mL为分离霉菌用)，内装10粒玻璃珠。4.5mL无菌水试管(每人5～7支)。4.其他物品无菌培养皿，无菌移液管，无菌玻璃涂棒(刮刀

4、)，称量纸，药勺，橡皮头，10%酚溶液。实验2-1土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化（一）系列稀释平板法1.取土样选定取样点，按对角交叉（五点法）取样。先除去表层约2cm的土壤，将铲子插入土中数次，然后取2～10cm处的土壤。盛土的容器应是无菌的。将5点样品约1kg充分混匀，除去碎石、植物残根等杂物，装入已灭过菌的牛皮纸袋内，封好袋口，并记录取样地点、环境及日期。同时取10～15g，称重后经105℃烘干8h，置干燥器中冷却后再次称重，计算含水量。土样采集后应及时分离，凡不能立即分离的样品，应保存在低温、干燥条件下，尽量减少其中菌种的变化。实验2-1土壤中细菌、

5、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化2.制备土壤稀释液称土样1g于盛有99mL无菌水的三角瓶中，充分振荡，此即为10-2浓度的菌悬液。用无菌移液管吸取悬液0.5mL于4.5mL无菌水试管中，用移液管吹吸三次，摇匀，此即为10-3浓度。同样方法，依次稀释到10-7。稀释过程需在无菌室或无菌操作条件下进行，稀释过程见图2-1。实验2-1土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化图2-1稀释分离过程示意图实验2-1土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化3.接种分离不同的微生物类群采用不同的稀释度，参考表2-1进行选择。从稀至浓分别吸取各浓度稀释液1mL于各平皿中（每个

6、稀释度每种做2-3个培养皿，并注意做好浓度及培养基种类标记），同时做空白对照，倒入熔化后冷却至45℃～50℃左右的相应培养基，见图2-2，轻轻地摇动并旋转平皿，使菌悬液与培养基混合均匀，水平静置待凝，倒置于相应温度的培养箱中培养，2～5天后，观察菌落情况及计数。实验2-1土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化图2-2稀释分离无菌操作图1.包装纸套中取出无菌移液管；2.安装橡皮头，勿用手指触摸移液管；3.火焰旁取出土壤悬浮液；4.灼烧试管口及移液管吸液口；5.在火焰旁对试管中土壤悬浮液进行稀释；6.用手掌敲打试管，混匀土壤稀释液；7.从最小稀释度开始，将稀释液加入无

7、菌培养皿中；8.将融化冷凉至45～50℃培养基倒入培养皿内；9.用毕的移液管装入废弃物缸中浸泡消毒后灭菌洗涤实验2-1土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化4.培养冷凝后，将平板倒置于在各自适宜的温度下培养，培养一定时间后观察。5.计数选菌落单个分散、菌落数适量且各平行皿数量接近的稀释度的平皿计数。通常细菌和放线菌选取菌落数在30～300之间的平皿，霉菌选菌落数在10～100之间的平皿，最后换算成每克干土所含菌数，记录于表2-2。实验2-1土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化表2-2样品中四大类微生物的菌落数