厌氧微生物的分离与培养.doc

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1、厌氧微生物的分离与培养一、实验目的熟练掌握Hungate厌氧操作技能，了解和掌握厌氧微生物的培养基配制，并进行分离纯化。二、实验用具装有分压表的氮气钢瓶，氢气钢瓶，调压变压器，铜柱和铜柱固定架，高圧灭菌锅，厌氧管（15ml），厌氧瓶（50ml）,异丁烯橡胶塞、电炉、圆底烧瓶（500ml.1000ml）＞各种规格的定量注射器（lml、2ml,5ml）,18#针头,酒精灯,酒精棉等。三、实验操作（一）、高纯无氧N2的制备1、接通电源：把输出电压缓缓从（）伏分级升到50-90伏之间（调电压的过程持续大约2・3s就可以了）。大约20分钟后，铜柱温度能达到35（TC左右（输出

2、电压禁止长时间超过90V以上，否则会导致铜玻璃柱变形•直至破裂，甚至发生安全事故）。2、待铜柱温度升至350°C左右时,加热套触摸起来比较烫，开启氢气钢瓶并形成气流，使铜柱内的铜丝还原（反应速率很快，儿秒钟见效，还原与否可以从铜丝颜色的变化看到，同时柱内会产主水蒸气，氧化铜与氢气反应所致;通氢气的时候最好打开窗户，一定熄灭操作台边上所有明火，包括酒精灯和电炉）。3、待铜丝被氢气还原呈现纯紫铜铮亮色，同时把里面的水蒸气也排出完全后，关闭氢气钢瓶，压力表指针降为零;打开氮气钢瓶，气流大小以把针头对准操作者手背5cm距离明显感觉到气流为宜，并随时注意气流是否足够。4、使用

3、完毕后，先关紧氮气钢瓶，使压力表的指示针回至零位，接着关闭电源，使调压变压器调节指示回至0伏处。（二）、无氧无菌水的配制1.将500ml一定浓度的NaCI水溶液（防止稀释时细胞涨破）沿玻璃棒倒入I古］定在铁架台上的1000ml圆底烧瓶中（选择合适的圆底烧瓶，水不可太满，否则水沸腾时容易溅出），最好放入儿个防爆玻璃珠。向500ml水中加入终浓度为0.00%的刃天青（resazurin）,即加入0.5ml的1%。刃天青母液（W/V）,并加入0.25g半胱氨酸（L-Cysteine）（终浓度0.5%。）。在烧瓶外壁溶液水平面处划一刻度后，加入适量水（因为蒸发会损失部分水分

4、）。煮沸5-10min（视所加水总昴而定），刃天青会根据水中含氧戢的下降经历紫色-红色-无色的颜色变化，当溶液变为无色后，再盘沸5min,然后通高纯氮气l-2min（赶走空气）。2.分装的过程可以不用继续加热，用10ml的定杲注射针筒抽进氮气流，再打出（三次以上）洗气，然后抽取9ml无氧水注入已换气的15ml厌氧管中（抽取注射过程中应迅速利落，与空气接触时间应缩至最短）；注入厌氧管后，需要等待通气5s-IOs,以置换瓶中空气，在抽出氮气流针头的同时塞紧异丁烯橡胶塞（操作要领：抽出针头时要注意，橡胶塞应该先半扣到瓶口，然后用右手食指掀住，左手扌里住通气针头慢慢抽出针头

5、，橡胶塞可能会外翻导致漏气等，此时将针头往瓶内伸，使塞子恢复原样，有时需要反复多次，视塞子大小而定，最后拔出针头，拔出同时立即将塞子塞进管口），最后旋紧盖子。3.121°C高压蒸汽灭菌20mirio（三）、专性厌氧菌液体培养基配制（以制备1000ml为例）1、按照配方配制培养基，定容后，加入1ml的I%。刃天青母液（W/V）（终浓度0.00%）,0.4g的半胱氮酸（L-Cysteine）（终浓度（）.4%。），用NaOH或KOH调节pH值（resazurin和半胱氨酸对培养基的pH有影响，应加入后再测pH）。2、制备高纯氮气，操作过程同（一）；将厌氧管固定到铁架台的

6、夹子上并通氮气，在培养基中加入5%Na2S-9H2O溶液，使其终浓度为0.5%。，用枪吸取适量培养基注入到厌氧管（或厌氧瓶中），通气10-20S,塞上橡胶塞，旋紧盖子。3、厌氧试管用牛皮筋扎成7支或者10支一捆即可灭菌，121C湿热灭菌20mina（四）厌氧菌固体培养基配制1、同（三）1。2、取上述培养基注入母液圆底烧瓶中（可以预先在圆底烧瓶外壁用记号笔划上体积刻度），再加琼脂粉和适量蒸憎水以弥补在煮沸过程中蒸发的损失量。然后煮沸l5-20mins,驱除培养基中的溶解氧。（应特别注意：融化的固体培养基在沸腾时容易从烧瓶瓶口溢出引起电炉短路，从而将电炉烧坏），在接近沸

7、腾时要把电炉移开。3、煮沸10分钟后，开始通高纯氮气；将厌氧管固定到铁架台的夹子上并通氮气，fillA5%Na2S-9H2O溶液，使其终浓度为0.5%“然后用l（）ml的定量注射针筒取5ml培养基注入15ml已换气的厌氧试管中。（注意：因为是I古I体培养基，注射器活塞处容易被琼脂粘住，使得封闭性较高，相对來说不易变红，但是也会有少许颜色，不用担心，同样加入少量硫化钠到管了或者瓶子内即可）。4、灭菌后的培养基取出來，就进行滚管操作。使灭完菌还未冷却的固体培养基在桌面匀速滚动,培养基会均匀固定在厌氧管壁上；也可以做成斜面状，但是如果是分菌的话应该是滚管更加好点，因为