大鼠海马神经元的培养及细胞培养注意事项.doc

《大鼠海马神经元的培养及细胞培养注意事项.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、1.成年大鼠海马神经元的培养•步骤1.获得海马细胞♦大鼠乙瞇麻醉，断头处理；♦迅速解剖海马组织，置于含有2ml4°C的HibernateA/B27的35mm的培养皿中；♦随后将其移入含有同上培养基的培养皿，去除脑膜及多余的脑白质（？）;♦将海马移入组织切碎机冷处理台面上事先用HibernateA/B27润湿的滤纸上，沿海马长轴将组织切成0.5mm的薄片，随后将其移入含有5ml4°C的HibernateA/B27的离心管中；♦30°C震荡8mino♦大吸管将其移入含有木瓜蛋白酶（预热至30°C）的离心管，置于170rpm的旋转平台（保持组织片

2、悬浮状态），30°C水域温育30min；♦将海马组织切片移入15ml含有2mlHibernateA/B27的离心管中，30°C温育5min,吸管吹打10次（30s）,静置2min,将上清移入另一离心管，重复上述步骤2次；2.梯度分离♦将细胞悬液加入Nycoprepgradient（4ml）的上方，室温，1900rpm,离心15min；去除最上方的碎片；吸管收集含有细胞的部分；用5mlHibernateA稀释；第三层富含神经元;将第四层用2mlB27:NeurobasalA重悬，1100rpm离心lmin；3.盖玻片处理：50ug/mL多聚赖

3、氨酸（无菌水溶解）包被过夜，吸去多余的多聚赖氨酸，无菌水漂洗一次，自然干燥lh；4.♦细胞接种：以目标密度稀释于B27:NeurobasalA,以每盖玻片60到120U1接种，置于5%CO2:9%02中孵育lh；♦将盖玻片移入24孔培养板中,每孔以0.4ml37°CB27/NeurobasalA漂洗一次，去除未贴壁细胞及细胞碎片；改用0.4ml的生长培养基；♦培养后4天，每3・4天更换一半培养基；新的培养基中的FGF2含量是远培养基的2倍；1.培养器皿的准备：1）溶液瓶一一装配各种溶液一一输液瓶；2）螺口瓶一一血清或培养基；3）培养瓶一一细

4、胞培养一一一般采用带螺口的，清洗时注意防止盖子中垫片的丢失；4）培养皿——细胞组织的分离、培养、染色——包括直径为30mm、60mm、120mm5）血球细胞计数板细胞计数6）移液管一一连接上手动（吸耳球）或电动负压吸取装置一一在移液管尾部塞入少量脱脂棉；7）离心管一一分离、漂洗、收集细胞一一一般选用螺口带盖的；Eppendorf——塑料尖底带盖的离心管8）磁力搅拌器：用于神经细胞的分离机溶液的配置；最好配合使用可调温度的加热装置；可用高压蒸汽消毒。9）加样器：微量加样器般采用紫外线消莓：超净台内，＜30cm,20〜30min；移液器吸嘴置于

5、移液器吸嘴盒中高压消毒。10）培养板（塑料消毒密封装备的即用型）一一盖板及带圆孔的底板；1.无菌室操作规范：1）使用无菌间前先用无菌间的紫外灯照射30min,然后打开通风装置30min以消除实验室中的臭氧。操作结束后及时清理无菌间，紫外灯照射20mino2）进入无菌间前洗手，带好口罩、手套，更换无菌间的鞋子、衣服方可进入2.超净台操作规范：1）超净台使用前先用7（）〜75%酒精擦拭，然后用超净台的紫外灯消«30min,关灯打开风机后使用；使用完成后及时清理台面并用酒精擦拭台面；2）超净台内不放与实验无关的东西；3）超净台内非一次性物品都需灭

6、菌处理，不能高压灭菌的用70%-75%的酒精消毒；4）操作人员的手套用70%-75%的酒精消毒方可进入超净台操作；5）操作时尽量接近酒精灯；拿取吸管时避免接触使用端；不要在开口器上方操作；吸取不同液体用不同的吸管；吸管不接触瓶口；培养用吸管、培养瓶等开口常规在酒精灯上过火；3.常用仪器的使用：（一）电热干燥箱：1）用于玻璃器皿的消毒，而塑料、橡胶制品及金属器械不用于干热消毒2）干热消毒的温度一般为160-170°C；用于RNA实验的器皿为250°C；3）进行消毒后，鼓风和升温同时开始，待温度升至I00°C时，关闭鼓风；消毒结束后，待温度降至

7、100°C以下时打开箱门；4）消毒完成后，将灭菌处理的器皿置于56°C电热干燥箱内长期保存（二）CO2培养箱1）将不透气的培养瓶/培养皿置于培养箱时，应旋松螺口使之与外界气流相通维持PH的恒定；取出是应旋紧开口；2）保持培养箱内空气的洁净，定期用酒精或紫外线消毒；3）保持培养箱内较高的湿度一一定期在外箱内加水或将无菌潮湿的纱布置于托盘内；（三）高压蒸汽灭菌器——适用于玻璃器皿、塑料器皿、橡胶制品、金屈制品及培养用水、平衡盐液、布料的消毒灭菌。1）灭菌的液体应置于耐高温的玻璃器皿中，容量为总容量的1/2〜3/4,瓶塞要有通气口；5・培养用液：

8、（一）水1）培养用水一般使用三蒸水，或者二蒸水+去离子处理；高压蒸汽灭菌后使用；2）新鲜使用，一般不超过2周；3）外购的蒸馄水一般为金属蒸傭器制备，一般需要用石英或玻璃蒸馄器在蒸