海马细胞培养与鉴定

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1、3.1海马原代培养操作准备:1、取海马：培养皿6个（3对），D-hanks（100ml,提前预冷），75%酒精，眼科银2把，小剪刀3把，小银子4把（三个弯头，一个直头），冰袋3个，中号银一把。2、细胞室：小dish,多聚赖氨酸（1个EP）,纸抽，细胞剪，胰酶（2个EP）,DMEM（10%胎牛血清+青霉素+链霉素,提前拿出），离心管2个,24孔板1个,细胞筛2个，废液缸1个,D-hanks3、分装:胰酶:lml、D-hanks:100ml.青霉素:500uk链霉素：500uk胎牛血清:10ml、DMEM：90ml、B27：40ul>Neur

2、obasal：1.6ml4、玻璃器皿：移液管，培养皿，24孔板内的玻璃片，泡酸过夜，口来水清洗10遍，一蒸10遍，三蒸3遍，烤干，高压，再烤干步骤:1>培养前30min包被多聚赖氨酸置于培养箱中备用：2、75%酒精浸泡鼠,断头取脑（1把中银，1把中剪）I3、剥离海马（D-hanks液，冰盒，4把小锻）4、去血管、被膜（显微银2把）I（进细胞间）5、吸去多余D-hanks,剪碎,吸入15ml离心管6、D-hanks：胰酶=1订,吹打20次I7、15-20min,37°C,期间5min震荡一次I1:1比例加（DMEM+青链+胎牛血清）终止消

3、化，吹打20次I9、配平，lOOOrpm,5minI10、弃上清，得沉淀I11、加（DMEM+青链+胎牛血清）,吹打20次12、100目过筛,13、放入15ml离心管,吹打14、配平,lOOOrpm,5min15、弃上清,得沉淀,加DMEM，吹打116、200目过筛117、计数(1X106)118、500微升/孔(24孔板)119、24孔板放入恒温培养箱中,37°C,5%CO220、笫二天换Neurobasal+B27(N:1.6ml,B27:40ul)I21、隔三天换液注意事项:1、取海马的操作过程要迅速，提高神经细胞的存活率。2、从

4、断头处死鼠到胰酶消化前整个过程都要在冰上进行。3、如果是胎鼠，不要取一个分离一个，而是要快速把所有胎鼠大脑都迅速取出放到预冷的液体中。4、一定要尽可能的去掉所侑的血管和血管膜。5、吹打动作要轻柔，以免损伤细胞。6、种板吋密度很重要，过密和过稀都会影响细胞牛长。7、种板后需轻摇晃板，切记！不能圈圈摇晃。应左右平行，上下平行摇晃。3.2海马细胞的鉴定：取培养7-9天的细胞海马神经细胞特界性抗体：神经元特界性烯醇化酶(NSE)、微管相关蛋口质2(MAP2)、生长相关换蛋白43(GAP-43)NSE：神经元特异性烯醇化酶，血清NSE是神经元和神经

5、内分泌细胞所特冇的一种酸性蛋门酚GAP-43：GAP-43是--种膜相关的鳞蛋口，与神经纤维牛长的调节有关，主要分布于海马神经元的轴突MAP2：MAP2是一种细胞骨架蛋白，定位于海马神经元的胞体和树突。方法:辣根过氧化物酶标记SABC法(NSE,1:100),F1TC标记免疫荧光法(MAP2,l:100;GAP・43,1:250)。鉴定标准：NSE的DAB显色结果：NSE免疫阳性反应物呈棕黄色颗粒，主要分布在神经细胞的胞浆及部分鮫粗大的突起中，胶质神经细胞不着色，阴性对照细胞未件着色。化学染色显示海马神经细胞形态均匀，体积相似，胞体饱满，

6、呈椭圆形或多边形。GAP-43的荧光显色结果：阳性反应物呈明亮的绿色荧光，反应物主要分布在胞体和粗人的轴突，树突无染色，胶质细胞无染色。染色显示培养一周左右的海马神经冗胞体饱满，呈椭圆形，轴突粗大发达。MAP2荧光显色结果：阳性反应物呈绿色银光，反应物分布于神经元的胞体和树突，轴突及胶质细胞均不染色。染色显示培养7、8天的海马神经元树突发达，相互交错，形成极发达的神经纤维网络。辣根过氧化物酶标记法：戊二醛交联法和过碘酸盐氧化法(常用)戊二醛交联法操作步骤：(1)称取HRP25mg溶于1.25%戊二醛溶液中，于室温静置过夜。I(2)反应后的

7、酶溶液经SephadexG-25层析柱，用生理盐水洗脱。流速控制在1ml/1分钟,收集棕色流出液。如体积大于5ml,则以PEG浓缩至5ml。放置25ml小烧杯中，缓慢搅拌。I(3)将待标记的抗体12.5mg用生理盐水稀释至5ml,搅拌下逐滴加入酶溶液中。I(4)用IMPH9.5碳酸缓冲液0.25ml,继续搅拌3?小吋。I(5)加0.2M赖氨酸0.25ml,混匀后,置室温2小时。⑹在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸钱，置4C1小时。(7)30()0rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸钱洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15MPH7.4的PB

8、S中。I(8)将上述溶液装入透析袋中,对0.15MPH7.4的PB缓冲盐水透析，去除钱离子后(用荼氏试剂检测),10,0001-pm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。