原代海马神经元细胞培养.docx

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1、原代海马神经元细胞培养溶液的配制：(1)4%多聚甲醛溶液：4g多聚甲醛溶于100mlpH=7.4的0.01mol/lPBS中，混匀过滤，室温保存。(2)磷酸盐缓冲液（PBS）（0.01mol×l-1）：KH2PO4，0.1g；Na2HPO4×12H2O，1.7g；KCl，0.1g；NaCl，4.0g，双蒸水加至500ml，pH=7.2～7.4。用0.2mm滤膜过滤，4℃保存。(3)1%蛋白酶的配制：用磷酸缓冲液（pH=7.2～7.4）配制成浓度为1%的胰蛋白酶母液冻存。使用时，用解剖液稀释至0.25%。(4)培养皿涂被多聚赖

2、氨酸：配制0.01%的多聚赖氨酸，分装冻存。将上述多聚赖氨酸放入培养皿中涂两遍，自然晾干后备用。(5)解剖液：葡萄糖，3.0g；蔗糖，7.5g；NaCl，8.0g；KCl，0.4g；Na2HP04×7H20，0.18g；KH2PO4，0.03g；HEPES，2.14g；加双蒸水1000ml，调pH=7.0～7.4，过滤，4℃保存。(6)种植液：DMEM79%，胎牛血清，10%；马血清，10%；谷氨酰胺培养液1%。(7)饲养液：Neurobasal培养基，97%；谷氨酰胺培养液，1%；B-27，2%。(8)阿糖胞苷：用双蒸水配

3、制成浓度为lmg×ml-1的母液储存。用0.2mm滤膜过滤，-20℃储存。使用时，取6ml母液加入2ml培养液中，终浓度为3mg×ml-1。（根据实验情况调整浓度）大鼠原代海马神经元细胞的培养(1)新生SD大鼠（＜12h），75%酒精浸泡消毒后断头，剥离出全脑并将其放入盛有解剖液的培养皿中。(2)在解剖液中解剖大脑，分离出海马，移入另一盛有解剖液的培养皿中。在分离出全部的海马后，去除血管等组织，然后用剪刀将海马分成数小块，放入盛有0.25%胰蛋白酶的培养皿中，将培养皿放入9%CO2、37℃消化20min。(3)将培养皿中的海

4、马碎片移入离心管中，去除含胰蛋白酶的液体并用种植液将海马碎片冲洗2～3遍，终止酶的消化作用。(4)在离心管中加入2ml的种植液，用口径递减的吹打管轻轻吹打海马碎片数次，将上清液吸出备用，再加入2ml的种植液后，用吸管吹打数次，将上清液吸出备用，如此反复数次，至海马碎片全部被吹打散开。（每次吹打10次，吹打时注意不要吹入空气，吹打尽量轻柔）(5)吸出的上清液再加入种植液调整其浓度，用200目细胞筛过滤。(6)将上述滤过的液体混匀后分装入已涂有0.1mg×ml-1多聚赖氨酸的96孔板上，使分散的细胞计数约为0.3x106×ml-

5、1。然后将96孔板放入9%CO2，37℃细胞培养箱中培养。(7)12h后观察细胞，镜下可见多数细胞贴壁生长。生理盐水冲洗细胞2遍以上以去除细胞碎片然后换上已平衡好的饲养液。(8)培养36h后加入阿糖胞苷3mg×ml-1以抑制胶质细胞的分裂生长。(9)加入阿糖胞苷后12h换液。以后每3d半量换液，饲养至7～14d可以进行实验。(10)或种板40min后，更换饲养液。种板后12h，更换饲养液。然后每3天半量换液。注：第一种方法细胞纯度高，但对细胞损害较大，需要较高培养技术。培养的细胞适用于MTT等实验。第二种方法细胞纯度较高，对

6、细胞损害较小，细胞状态好。培养的细胞适用于膜片钳