原代培养大鼠海马神经元内mklp1树突靶向机制研究

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1、第二军医大学博士学位论文原代培养大鼠海马神经元内MKLP1树突靶向机制研究姓名：徐晓辉申请学位级别：博士专业：神经生物学指导教师：陈宜张20040501第二军医大掌博士论文～畋LPleGFPCHOR●PCRPCRDNAdNTPsO．D．SDSCNSbDMTAA英文缩略词有丝分裂动力蛋白类似蛋白l增强型绿色荧光蛋白中国仓鼠卵巢癌细胞逆转录聚合酶链式反应聚合酶链式反应脱氧核糖核酸四种脱氧核苷酸总称光密度十二烷基硫酸钠中枢神经系统碱基对微管氨基酸第二军医大学博士论文中文摘要神经元是有极性的细胞，在发育过程中，轴突和树突分别在不同方向发出，决定了神经元的极性。树

2、突因其具有接受，计算，整合外部信号，并通过对外部信号的反应改变存在的突触结构来加强或减弱突触联系，因此被称为“神经元的大脑”。己知树突与轴突的微管排列是不一致的；在轴突，微管只以其正端(plusend)朝向轴突末端，排列成均一一致的微管束；在树突，则不仅有正端向远端的微管束，也存在负端(minusend)远端的微管束，后者所占比例从树突近胞体端的80％到远端的20％。一类新的kinesin家族的动力蛋白如KIFC2，在树突内丰富，可沿微管向其负端运输，提示树突内的微管负端向远端的结构极有可能与树突内某些特异成分的运输有关，而轴突与树突内的微管运输是功能蛋

3、白靶向的重要原因。因此在树突内的负端向远端的微管束与树突功能的维持密不可分。树突内微管极性排列不一致与一种动力蛋白类似蛋白MKLPl(mitotickinesinlikeprotein1)有关。它可以携带负端向外的微管束从神经元的胞体进入树突内，从而造成树突内不仅有正端向远端的微管束，也存在负端(minusend)向远端的微管束。应用抗MKLPI抗体的实验证明，神经元发育早期，当突起尚未确定是轴突或树突时，MKLPl分子局限在胞体。在原因未知的条件下，它进入除一条突起之外的其余突起，促使这些突起最终成为树突，而另一条则为轴突。可见MKLPl分子本身在神经

4、元内并非是自由扩散的。在成熟的神经元，也需要MKLPl分子正确分布到树突来维持树突正常的形态与功能。可见MKLPl是～种明确有轴、树突差异分布的动力蛋白，并且这种动力蛋白的存在造成了树突与轴突微管分布的差异并进一步造成了轴、树突形态与功能的差异。因此了解MKLPl本身的树突靶向机制对于了解轴、树突分化无疑是十分重要的。前人的实验认为，MKLPl蛋白分子在经过c端的剪切后才能进入树突，理由是在昆虫卵巢细胞sf9中表达MKLPlN．端一半氨基酸序列可使之形成MT丰富的突起，这种突起形态及内部微管排列类似神经元的树突，但表达全长分子的第一军医人学博士论文MKL

5、Pl却集中在核内，而并不能使sf9细胞发出突起。GFP融合蛋白定位的方法发现MKLPlC．端～半氨基酸序列与GFP融合蛋白定位于CHO细胞核。MKLPl之所以能分布于树突至少应当有两方面的原因'其一是MKLPl分子本身的，即MKLPl分子中的哪一个或哪些结构域是负责这一功能的，其二是细胞内MKLPl以外的蛋白分子负责与NKLPl相关结构域的相互作用从而导致MKLPl的特征性分布。本项研究的目的就是试图确定MKLPl分子内部负责MKLPl树突靶向的结构域。预实验先用原位杂交方法证明MKLPlmRNA分子在成年SD大鼠脑神经元内表达，在树突丰富的小脑浦氏细胞

6、，海马神经元表达量尤其丰富。在40um组织切片上不能发现mRNA分布到突起内。eGFP标记的MKLPl融合蛋白仍然分布于树突即与MAP2完全重合。由此证明MKLPl分布到树突应是蛋白的靶向。本研究采用增强型绿色荧光蛋白eGFP标记MKLPl形成融合蛋白的方法研究MKLPl蛋白的定位问题：构建了十三种eGFP标记的MKLPl分子的缺失突变体，并将其转染E18原代培养大鼠海马神经元，了解其是否会特异分布到树突，并观察其分布变化咀期找到负责MKLPl树突靶向的结构域。MKLPl各突变体转染原代培养E18SD大鼠海马神经元有四神主要的表型：1，主要分布在树突胞体

7、，与内源性MKLPl分布大致相同的有MKLPl(856)剪切体，162--856，D460--711，460--711。MK工Pl(856)一eGFP的绿色荧光的分布与MAP2完全重合。162--856相当于加上一个“马达”域之后绿色荧光的分布与MAP2重合，恢复了MKLPl分子树突定位。D460--71l相当于MKLPt“马达”域加上MKLPl的“尾”域，绿色荧光的分布与MAP2重合，也重新获得MKLPl分子正确的树突定位。2．主要分布在胞体内的有461—856，711—856。711—856相当于MKLPl的“尾”用绿色荧光蛋白标记，除少部分可在树突

8、内表达，大部分阳性细胞的绿色荧光蛋白集中于胞体内(85／100)，也就是说，单独