[精品]海马鉴定

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1、神经元鉴定采用神经元特界性烯醇化酶(NSE)免疫纽.织化学方法(LSAB法•标记式链霉亲和素■生物素免疫组织化学方法)对原代培养的神经元进行鉴定。取出培养8天的神经细胞，吸掉培养液用温(37°C)0.1mol/LPBS(pH7.4)洗2遍，4%多聚甲醛固定3()分钟，再用PBS轻洗两遍，风干备染。固定后的细胞用().()1mol/LPBST(pH7.4)浸洗5分钟,3次;用0.3%H2O2的80%T醇溶液氧化10分钟;流水洗5分钟;PBST洗5分钊J3次;滴加阻断液止常山羊血清30分钟;滴加一抗(神经元特异性希醇化酶，NSE鼠抗

2、人单抗)125,4°C过枚，阴性对照用PBS代替一抗;PBST洗5分钟，3次;滴加二抗(羊抗小鼠)室温90分钟;PBST洗5分钟3次;滴加链霉卵口素HRP复合物室温90分钟;PBST洗5分钟3次;0.05%DAB・0.03%H202显色液，显色5〜10分钟;流水洗，廿油明胶封片，光镜下观察。NSE免疫组化染色结果NSE免疫组织化学染色显示：NSE免疫反应物呈棕黄色，颗粒状，阳性反应颗粒主要分布于神经细胞的胞浆及较粗大的突起屮，神经胶质细胞不着色，阴性对照未见细胞着色。培养8天的神经细胞均匀地分散于胶质细胞上面，胞休呈鬪形或者多边

3、形，伸出较长的突起，神经细胞生长良好，发育成熟，可以进行实验研究培养结果倒置相差显微镜观察原代培养大鼠海马神经细胞形态结构大鼠海马神经细胞于倒置相差显微镜下观察：接种的神经细胞最初呈圆形;接种1〜2小时儿乎全部帖附于多聚赖氨酸处理过的小盖玻片和培养板壁。此时细胞分散，呈现强折光的胞体，核不可见。培养第二天大部分细胞已经伸出突起，胞体饱满，光晕明显，胶质细胞很少见。第三天神经细胞突起更长，胞体逐渐变大,并可见少量胶质细胞;第4〜6天神经细胞突起均已连接成神经网络，呈丝带状。培养7〜8天，细胞胞休饱满，呈圆形、梭形、三角形或者多边形

4、，细胞核大而鬪，位于胞体中央或者偏于一侧，核仁清晰可见，经胞体伸出大量突起并和互连接成神经网络，此时神经细胞已经发育成熟神经细胞NSE染色抗血清的SABC法染色取培养6天的6孔培养板中的盖玻片进行神经元特界的烯醇化酶（neuron-specificenolase,NSE）抗体染色和抗神经微丝单克隆抗体一SMI-32mAb免疫组织化学染色：弃去培养液，0.01MPBS清洗3次，每次5分钟;4%多聚甲醛室温固定1小时；0.01MPBS清洗3次，每次5分钟；加入0.3%H2O2甲醇，作用10分钟，以去除内源性过氧化氢酶；0.01MPB

5、S清洗3次，每次5分钟后；移到37°C湿盒，将10%绵羊血清滴加在盖玻片上，每孔3~4滴，放入37°C温箱孵育20分钟；吸去封闭液，勿洗，加入一抗（1：200兔抗鼠NSE抗体或仁2000鼠SMI-32mAb）,每片加3〜4滴，4°C冰箱过夜；0.01MPBS清洗3次，每次5分钟；将二抗（1：200生物素化的山羊抗兔或羊抗鼠IgG）滴加在盖玻片上，每孔3〜4滴，放入37°C温箱孵育60分钟；0.01MPBS清洗3次，每次5分钟；即用型ABC液滴加在盖玻片上，放入37°C温箱中孵育60分钟；0.01MPBS清洗3次，每次5分钟；滴加

6、DAB显色液作用3〜10分钟，显微镜下控制；酒精脱水，二甲苯透明，树胶封片。四川航嘉生物医药科技有限责任公司多聚甲醛价格每瓶12元发货期7天武汉博士徳生物工程有限公司正常山羊血清（封闭）每瓶10元（即用型）上海达豪生物科技冇限公司NSE/神经元特界性稀醇化酶上海江莱生物科技有限公司羊抗大鼠IgG上海双螺旋生物科技有限公司PBST价格：40元/罐产地：上海北京赛驰生物科技冇限公司DAB染色试剂盒待海马神经元发育成熟后(约14d后)，取出爬片，选择NSE作为海马袖经元的标志物，按标准的免疫细胞化学染色SP法进行鉴定。方法如下：①取出

7、的爬片用0.01%PBS清洗2次，4%多聚甲醛固定40min,PBS浸洗5min；②3%H2O2孵育10min以消除内源性过氧化物酶活性；③滴加试剂A进行封闭亨室温约15min,吸去，勿洗；④加入I抗(NSEJ:50)MC过夜JBS冲洗3minX3次;⑤滴加n抗，室温15〜20min,PBS冲洗3min,3次；⑥滴加试剂C,室温15min,PBS冲洗3minX3次；⑦DAB显色试剂盒显色3〜5min,PBS冲洗3minX3次。最后经酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片，镜下观察,摄片。以PBS(0.01mol•Li)缓冲液代替1抗

8、作阴性对照。