超高效液相色谱串联质谱联用法快速筛选3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂.pdf

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1、第4l卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第7期2013年7月ChineseJournalofAnalyticalChemistryl0l3～1018DOI：10．3724／SP．J．1096．2013．20961超高效液相色谱串联质谱联用法快速筛选3-羟基-3．甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂吴琼王世聪马俊锋李婉南邢述付学奇(吉林大学生命科学学院，分子酶学工程教育部重点实验室，长春130012)摘要建立了超高效液相色谱串联质谱仪(UPLC．MS／MS)检测酶促反应体系中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷

2、酸(NADPH)浓度变化，快速筛选3一羟基．3．甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGCR)抑制剂的方法。优化了HMGCR酶促反应体系和检测NADPH的色谱．质谱条件，探讨了NADPH的离子化试剂的作用和质谱碎裂机理。采用ACQUITYUPLCBEHAmide色谱柱(100mmx2．1mm，1．7m)，以三乙胺／六氟异丙醇缓冲液(pH=8．0)为流动相，流速0．3mL／min，柱温30℃，电喷雾离子源．多反应监测模式，对酶促反应体系中的NADPH进行分析。NADPH的峰面积与其浓度在0．05—50~moL／L范

3、围内呈良好的线性关系(r>0．9996)，定量限(S／N=10)为0．05p,mol／L。关键词超高效液相色谱串联质谱；还原型炯酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸；3-羟基-3一甲基戊二酰辅酶A还原酶；抑制剂筛选1引言3一羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-Hydroxy一3一methylglutarylCoAreductase，HMGCR)是体内催化3．羟基一3一甲基戊二酰辅酶A(3-Hydroxy-3-methylglutarylCoA，HMG—CoA)生成甲羟戊酸(Mevalonate，MVA)的关键酶，在

4、胆固醇合成过程中起到限制反应速度的作用，是胆固醇代谢的最重要的酶之一⋯。其反应原理如下：HMG—CoA+2NADPH+2H．HMGCRMVA+2NADP．+CoA(，1)体内过多的胆固醇会引起血脂偏高，进而诱发冠心病、心肌梗塞等心血管疾病，因此HMGCR成为治疗此类疾病的主要靶标酶_2J。目前，临床治疗高胆固醇症的药物主要为他汀类药物(如普伐他汀)，该类药能够竞争性的抑制HMGCR的活性，从而达到降低胆固醇的合成速率，降低血脂的目的，但其副作用近年来也屡见报道3l4J。因此开发新型的副作用小、效果明显的

5、HMGCR抑制剂，特别是从天然产物中筛选其抑制剂，已成为当今降血脂药物研发的一大热点。以往体外筛选HMGCR抑制剂，主要利用分光光度法和HPLC法J，通过检测上述反应中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸((Nicotinamideadeninedinucleotidephosphate，NADPH)的量的改变来评价HMGCR的活性变化。然而由于NADPH极性太大，在C色谱柱里几乎没有保留，且很多天然产物都有很强的紫外吸收，因此HPLC法无法将NADPH与抑制剂等酶促反应体系中其它物质分开，在筛选HMGCR抑

6、制剂的时候容易造成数据不准确。本研究利用超高效液相色谱串联质谱仪(UPLC．MS／MS)检测酶促反应体系中NADPH浓度变化，快速筛选HMGCR抑制剂的方法。该方法通过引入离子化试剂三乙胺／六氟异丙醇(TEA／HFIP)，显著增强了NADPH的质谱信号。相比紫外检测器有更强的信号，使得NADPH可以用质谱确证分析检测，相比HPLC法更为准确，特别适用于复杂天然产物中HMGCR抑制剂的筛选。同时对色谱分离中的色谱柱和流动相对分离效果的影响进行了探讨，优化了HMGCR酶促反应体系。利用本方法对绿茶、普洱茶和

7、红茶对HMGCR的抑制效果进行了比较。2012-09-24收稿；2012-l1一l5接受本文系教育部博士点基金项目(No．20090061110019)资助}E—mail：xingshu@jlu．edu．cn，fxq@jlu．edu．cn分析化学第41卷2实验部分2．1仪器与试剂ACQUITYUPLC-QuattroPremierXE超高效液相色谱一串联质谱仪(美国Waters公司)，配备WatersUPLC自动进样器，柱温箱，TUV紫外检测器，电喷雾离子源；ACQUITYUPLCBEHC和ACQUIT

8、YUPLCBEHAmide色谱柱(美国Waters公司)；Milli．Q超纯水器(美国Millipore公司)。NADPH、HMG—CoA、普伐他汀(美国Sigma公司)；Na2HPO4、NaH2PO、NaC1、KC1、二硫苏糖醇、EDTA(分析纯，北京化工厂)；甲醇(色谱纯，美国Fisher公司)；六氟异丙醇、三乙胺(阿拉丁试剂)；HMGCR自制；绿茶、普洱茶和红茶茶叶水提物为云南省茶深加工工程技术研究中心制备，均为茶叶与水1：10提取，