赭曲霉毒素A模拟抗原表位及噬菌体展示酶联免疫吸附分析法的建立.pdf

《赭曲霉毒素A模拟抗原表位及噬菌体展示酶联免疫吸附分析法的建立.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、第43卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第6期20l5年6月ChineseJournalofAnalyticalChemistry856—861DOI：10．11895／j．issn．0253-3820．140960赭曲霉毒素A模拟抗原表位及噬菌体展示酶联免疫吸附分析法的建立王吕熊斯诚邹旭强陈超超邵辉锋陈雪岚(江西师范大学功能有机小分子教育部重点实验室，生命科学学院，南昌330022)(南昌大学食品学院，南昌330047)摘要以驴抗鼠二抗包被微孔板，以捕获方式包被抗赭曲霉毒素A(OTA)单克隆抗体，利用

2、噬菌体随机七肽库筛选OTA模拟抗原表位，并以其替代检测抗原，建立了基于噬菌体展示技术的酶联免疫吸附分析(PhageEUSA)检测OTA的方法。结果表明，筛选获得的模拟OTA抗原表位七肽氨基酸序列为GMSWMMA。基于模拟表位噬菌体建立的PhageELISA方法半数抑制浓度(IC。值)为(0．15±0．02)rig／mL，检测OTA的线性范围为0．03～0．50rig／mL，OTA的检出限为0．03ng／mL，且PhageELISA与其它4种常见真菌毒素(黄曲霉毒素B1、伏马毒素Bl、脱氧雪腐镰刀菌烯醇及玉米赤霉烯

3、酮)无交叉反应。大米样品OTA加标实验表明，批内加标回收率为97．0％一115．2％，批间加标回收率为107．2％一123．1％，与ELISA试剂盒检测结果比较，无显著性差异。关键词赭曲霉毒素A；噬菌体展示肽库；模拟表位；酶联免疫吸附法1引言赭曲霉毒素A(OchratoxinA，OTA)是由曲霉属和青霉属的某些菌株产生的次级代谢产物，具有很强的肾脏、肝脏、生殖和神经毒性，且具有致癌、致畸和致突变作用。目前，国际上关于OTA污染的报道日益增多，受污染物种包括粮食作物(大米、玉米、小麦及大麦等)、药用植物、水果和坚果

4、、饲料等。家禽、猪、羊等进食受污染的饲料，会给养殖业带来巨大的风险；人食用这些受污染的食品会对健康产生潜在的损害。由于OTA对人类健康和农业经济的巨大危害，各国均制定了谷类食品中OTA残留量的严格标准，欧盟和我国规定OTA限量标准为5g／。检测OTA常用方法主要有高效液相色谱法(Highperform-anceliquidchromatography，HPLC)j、质谱分析法(Massspectrometry，Ms)J、高效液相色谱一串联质谱法(HPLC—MS／MS)、适配子比色法(Colorimetricapt

5、amersensors)、电化学方法(Electrochemicalmethod)J、薄层层析法(Thin．1ayerchromatography)Is]、表面等离子体共振(Surfaceplasmonresonance)生物传感方法J、酶联免疫吸附法(Enzyme—linkedimmunosorbentassay，ELISA)以及免疫层析试纸条(Chromatographicstrip)检测方法等。其中ELISA方法因具有特异性强、操作简单、灵敏度高等优点，已成为OTA快速筛查检测的主要方法。但ELISA方法在

6、试剂盒生产以及检测时不可避免接触OTA标品或OTA检测抗原，对生产和操作人员的安全造成潜在危害，并存在二次污染的隐患。应用噬菌体展示技术(Phagedisplaytechnology)筛选OTA的模拟抗原表位，可用其替代有毒的标品，建立相应的无毒检测体系。小分子抗原模拟表位筛选通常将特异性抗体直接包被微孔板，此时抗体以非定向方式与微孔板结合，因此存在包被抗体用量大、筛选获得的特异性模拟表位阳性率相对偏低的缺陷。本研究以驴抗鼠二抗包被微孔板，通过二抗与抗OTA单克隆抗体(anti—OTAmAbs)Fc片段的特异性结

7、合，使anti．OTAmAbs抗原结合部分充分暴露，提高OTA模拟表位筛选阳性率；并进一步以筛选获得的OTA模拟表位，建立了无毒的PhageELISA检测方法。2014—10-28收稿；2015-O4-22接受本文系国家自然科学基金(No．31160323)及功能有机小分子教育部重点实验室开放基金(No．KLFS-KF-201414)资助项目}E．mail：xuelanchen162@163．corn第6期王吕等：赭曲霉毒素A模拟抗原表位及噬菌体展示酶联免疫吸附分析法的建立8572实验部分2．1仪器与试剂DNM-

8、9602酶标仪(北京普朗新科技有限公司)；TGL一20M冷冻离心机(上海卢湘仪有限公司)；DHP-9082恒温培养箱(上海齐欣科学仪器有限公司)；ZWY．103B恒温摇床(上海智城分析仪器有限公司)；SW．CJ超净工作台(新恒实业有限公司)；Millipore超纯水仪(美国Millipore公司)。M13噬菌体随机七肽库(Ph．D．-7PhageDisplayPeptid