缩胆囊素分子印迹整体柱的制备及固相微萃取-高效液相色谱分析研究.pdf

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1、第43卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第8期2015年8月ChineseJournalofAnalyticalChemistry1130一l135DOI：10．11895／j．issn．0253-3820．150183缩胆囊素分子印迹整体柱的制备及固相微萃取-高效液相色谱分析研究李桦冀翔卫柳(武汉大学化学与分子科学学院，武汉430072)摘要采用抗原决定簇法，开展了对缩胆囊素(CCK)神经肽具有特异性识别和富集作用的新的分子印迹聚合物(MIP)整体柱合成与制备的研究。对MIP整体柱合成条件进行了系统的选择和优化，以缩胆囊素五肽(CCK5)为模板分子，在小移液器吸头中原位聚合制

2、备了可以特异性识别和富集CCK神经肽的MIP整体柱。用扫描电镜和红外光谱对该分子印迹聚合物进行了表征。将此MIP整体柱作为固相微萃取小柱，研究并优化了固相微萃取条件，结合高效液相色谱-紫外检测法，建立了脑脊液中CCK5和CCK8的分析检测方法；本方法成功应用于加标脑脊液中CCK神经肽的分离富集，CCK5和CCK8的检测限分别为4．38和15．95ng／mL，平均加标回收率分别为90．2％和87．6％，相对标准偏差分别为3．2％和3．9％。此CCK-MIP整体柱具有特异性强、经久耐用的特点。关键词缩胆囊素；分子印迹聚合物整体柱；固相微萃取；抗原决定簇1引言缩胆囊素(Cholecystoki

3、nin，CCK)是一种广泛分布于中枢神经系统的多型性神经肽，在中枢神经系统中CCK大部分以八肽CCK8(Asp—Tyr—Met-Gly-Trp—Met—Asp—Phe-NH2)形式存在；也有部分以五肽CCK5(Gly—Trp—Met—Asp—Phe—NH2)形式存在，这两种CCK型体具有相同的C端结构uJ。CCK对摄食、体温调节、学习和记忆等生理功能有重要的调控作用，3]，并且与多种神经和精神性疾病发病紧密相关。研究建立生物体液中缩胆囊素特异性和高灵敏的分析检测方法具有重要的生物医学意义。由于CCK在脑脊液和脑组织中含量低，目前报道的CCK定量检测方法大多采用高灵敏度的放射免疫法(RIA

4、)[5,63。但RIA方法需要昂贵的高特异性的抗体，且有交叉反应的缺点；而且RIA无法实现对中枢神经系统中多型性CCK的同时定量检测。建立高效和特异性强的CCK神经肽样品富集方法是实现CCK液相色谱分析的重要前提。分子印迹聚合物(Molecularlyimprintedpolymer，MIP)是以目标分子为模板合成的具有分子识别能力的聚合物。整体柱是由单体、交联剂、致孑L剂等混合物通过原位聚合而成的棒状整体【810]。MIP整体柱不仅具有分子印迹聚合物优异的识别能力，而且具有整体柱的高效、通透性好、传质速度快等特点，可结合固相微萃取(Solidphasemicroextraction，S

5、PME)，应用于复杂基质中痕量分析物的分离与富集¨”。抗原决定簇法分子印迹技术是以多肽或蛋白质中一个特异性的裸露短肽作为模板分子制备MIP来特异性识别整个多肽或蛋白质，大大降低了印迹成本，已在蛋白质印迹材料的合成中得以应用，如合成能识别血管紧张素u、酪氨酸磷蛋白的分子印迹材料。Papaioannou等n以CCK5为模板分子，以本体聚合法制备出了可以识别CCK8的MIP，但该报道仅研究了该MIP的选择性和吸附性能，未将其应用于固相微萃取或色谱分析。目前制备蛋白质或肽MIP的报道绝大部分使用本体聚合法，用该方法所制备的块状MIP需要经干燥、研磨和筛分等复杂过程，且在研磨时会破坏印迹位点。至今

6、尚无原位聚合法制备CCK神经肽分子印迹整体柱的相关报道。本研究采用抗原决定簇法，以缩胆囊素五肽CCK5为模板，首次以原位聚合法在移液器吸头中合成了CCK神经肽MIP整体柱，以此整体柱作为固相微萃取小柱，纯化并富集脑脊液中的CCK神经肽，结合高效液相色谱．紫外检测法(HPLC．uV)2015-03-06收稿；2015-05-21接受本文系国家自然科学基金(No．81171417)资助·E—mail：lihua@whu．edu．ca第8期李桦等：缩胆囊素分子印迹整体柱的制备及固相微萃取．高效液相色谱分析研究113l检测，建立了MIP—SPME对脑脊液中痕量CCK5及CCK8同时特异性富集和分

7、析检测的方法，获得满意结果。2实验部分2．1仪器与试剂1100型高效液相色谱仪(美国Aglient公司)，配G1315B光电二极管阵列检测器；Quant200扫描电子显微镜(荷兰FEI公司)；Nicolet5700红外光谱仪(美国Nicolet公司)；LSP01—1A型注射泵(保定兰格恒流泵有限公司)。CCK5五肽和CCK8八肽、亮啡肽、甲啡肽以及四肽YPLG(纯度>98％)购于上海吉尔生化有限公司；甲基丙烯酸(Methacryli