纳米探针芯片技术用于微量乙肝病毒DNA的检测.pdf

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1、第38卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第8期2010年8月ChineseJournalofAnalyticalChemistryl133～ll38DOI：10．3724／SP．J．1096．2010．01133纳米探针芯片技术用于微量乙肝病毒DNA的检测汪毅毛红菊臧国庆张宏莲金庆辉赵建龙2(上海交通大学附属第六人民医院，上海200062)(中国科学院上海微系统与信息技术研究所，上海200050)摘要利用两组探针修饰的微粒：(1)表面标记有可与待测乙肝病毒(HBV)DNA另一端结合的纳米金探针1(信号探针)以及可与信号探针部分结合的纳米金探针2(检测探针)；(2)表面标记

2、有可与待测HBVDNA一端结合的磁珠探针(捕捉探针1)。检测靶HBVDNA时，磁珠探针与信号探针在液相中可分别与HBVDNA靶序列一端结合最终形成三明治样结构。再以磁场将三明治样复合物从反应液中分离，以DTY溶液将信号探针从纳米金颗粒上洗脱。洗脱后的信号探针数量反映靶基因的多寡，信号探针一段与预先点样的基因芯片上的捕捉探针2结合，检测探针与信号探针另一段相结合，最后用银染液将检测探针显色从而得到靶目标DNA相对定量信息。结果表明，本检测方法的检测灵敏度达到10mol／L水平。检测时间少于1．5h，检测结果与HBVDNA水平呈现较好的线性关系且无假阳性结果；本方法有望用于乙肝病人血清

3、中HBVDNA的快速筛测及其它微生物基因的检测。关键词乙肝病毒DNA；纳米金探针；生物条形码扩增；纳米探针芯片1引言乙型肝炎是乙肝病毒(HBV)所引起的一种传播快、潜伏期长、危害广的传染病，我国慢性无症状HBV感染者或慢性无症状HBV携带者已超过1．2亿，是HBV感染者中存在数量最大的群体。采用有效的指标和方法实现早期诊断和病情监测对于控制传播、判断预后和指导用药都有重要意义⋯。PCR一直是临床上检测HBVDNA的主要方法，具有较高的特异性和灵敏度，但却存在依赖酶促反应，所用试剂较为昂贵且不易保存，所需周期长和易污染，反应完毕后对其扩增的靶基因较难定量的缺点。近年来，荧光定量PCR

4、试剂盒开始用于临床检测HBV，灵敏度高，定量分析效果好。其中，SYBRGreen法不需要设计特异性探针，成本较低，但易产生假阳性结果。而TaqMan探针法有着的特异性较好，但应用时需设计与目标序列互补的荧光探针J。基因芯片技术在医学各个领域中的应用日益广泛'。但现阶段芯片检测的灵敏度不够高，在检测核酸时低于PCR扩增的灵敏度；其次基因芯片检测技术一般采用荧光标记探针技术，需配套昂贵的仪器来阅读和分析杂交信号，存在着系统成本遗高，灵敏度低等问题；限制了基因芯片技术的应用]。近年来，基于纳米材料的分子检测技术已被用于病原体和肿瘤相关DNA检测10,11]、蛋白检测¨H以及microRN

5、A检测。纳米材料尤其是金纳米颗粒(Goldnanoparticles，AuNPs)，具有很好的生物相容性和较大的比表面积，金纳米粒子表面可以标记大量的生物活性分子(寡核苷酸探针或是蛋白分子)。Zhang等。将固定于金电极表面的探针DNA分子与靶分子结合，再加入与靶分子结合的纳米金探针，形成夹心结构，通过伏安法测定修饰在纳米金上的六氨合钌的氧化还原电流，可以识别和测定溶液中互补的靶DNA，制成了具有纳米金放大作用的DNA电化学生物传感器；或直接以硫化铅(PbS)超微粒和靶分子杂交，结合微分脉冲溶出伏安技术(DPASV)测定Pbn，从而间接判断靶分子的杂交情况。但是上述电化学方法检测灵

6、敏度仍不够高；且探针用量大，杂交过程繁琐，需专门仪器读取结果，限制了该方法的应用。Mizuo等引运用比色法检测靶DNA的存在，结合了靶DNA的纳米金探针(末端完全互补)在一定的盐离子浓度下会聚集。但其检测灵敏度不高，只能检测5O500moL／L的目标DNA分子。本研究基于Mirkin等¨开发的BCA技术，将纳米金颗粒标记的探针结合基因芯片方法用于2010-01-02收稿；2010-02-23接受本文系国家卫生部重大专项(Nos．2009ZX10004—105，2009ZX10004-301)和上海市科委项目(Nos．0952nm05700，09ZR1437800)资助E—mail：

7、hjmao@mail．sire．ac．ca分析化学第38卷HBVDNA的检测，进一步优化了纳米金探针标记步骤和杂交条件，可在较短时间内完成对HBVDNA的检测，灵敏度已能接近PCR反应的检测灵敏度，有望用于乙肝病人血清中HBVDNA的快速筛测。2实验部分2．1仪器与试剂Prosys5510A型芯片点样仪；JASCOV-670型紫外一可见光光谱仪。纳米金溶液(平均粒径为15rim)、基因芯片(本实验室自制)；杂交缓冲液(罗氏公司)；羧基化的磁珠(Invitrogen公司