禽流感病毒H5N1病毒颗粒中鸡胚宿主蛋白的质谱分析.pdf

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1、第4O卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第3期2012年3月ChineseJournalofAnalyticalChemistry376～380DOl：10．3724／SP．J．1096．2012．10591禽流感病毒H5N1病毒颗粒中鸡胚宿主蛋白的质谱分析王志武孙万春周悦丛中一周庆伟刘宁(吉林大学人畜共患病教育部重点实验室，长春130062)(吉林大学公共卫生学院，长春130021)(吉林大学药学院，长春130021)(吉林大学第二医院中心实验室，长春130041)摘要在A型流感病毒等许多包膜病毒的病毒颗粒中，除包含病毒基因组编码的结构蛋白外，还

2、包含来源于宿主细胞的多种蛋白。然而，在鸡胚内增殖的病毒颗粒所包含的宿主蛋白的种类尚不清楚。本研究采用20％～60％(w／w)蔗糖密度梯度离心法分离纯化了繁殖于鸡胚的流感病毒，并用十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis，SDS—PAGE)结合质谱法对纯化的流感病毒颗粒进行了全面的蛋白质组学分析。结果表明，在病毒颗粒中，除包含9种病毒编码蛋白外，还发现了12种来源于鸡胚的蛋白，如膜联蛋白A2、肽酰脯氨酰顺反异构酶B、过氧化物酶1、磷酸甘油酸激酶、丙酮酸激酶肌组织

3、异构酶等，以及2种细胞骨架蛋白(微管蛋白b_3和肌动蛋白)。关键词鸡胚；流感病毒；凝胶电泳；质谱分析1引言：包膜病毒是一类在核衣壳外包有脂质双层膜的病毒，包膜来自受感染宿主细胞的细胞膜或核膜。目前认为，成熟的包膜病毒颗粒中除包含其基因组编码的结构蛋白外，还包含多种宿主蛋白⋯。在病毒颗粒中已发现了系列宿主蛋白[2-51，其中一些蛋白对病毒的复制和包装有重要作用。流感病毒是一种包膜病毒，其成熟病毒颗粒含有9种病毒基因组编码的结构蛋白。通过蛋白质组学方法可对在Vero细胞中增殖的流感病毒进行分析，发现成熟的病毒颗粒结合有36种宿主蛋白[91。目前，此类研究均选择来

4、源于N-％动物的细胞株作为流感病毒增殖的宿主。在细胞培养技术发展起来之前，研究者多采用鸡胚作为流感病毒增殖宿主。由于成本低、产量高，鸡胚已成为生产流感病毒疫苗的主要宿主。但是，鸡胚与细胞株在很多方面存在差异。在鸡胚内增殖的流感病毒颗粒结合宿主蛋白的情况尚不清楚，因此有必要对在鸡胚内增殖的流感病毒颗粒所包裹的来源于宿主鸡胚的蛋白进行全面的分析。据此，本研究采用SDS-PAGE与质谱分析结合的方法，分析了纯化的在鸡胚内增殖的流感病毒颗粒的蛋白组成谱，发现除了9种病毒编码蛋白外，还有12种鸡胚宿主编码的蛋白结合于病毒颗粒内。2实验部分2．1仪器与试剂OptimaL

5、-100K超速离心机(美国BeckmanCoulter公司)；ZipTipCl8PipetteTips微量层析柱(美国Millipore公司)；PicoTip电喷雾针(美国NewObjective公司)；纳升电喷雾源(丹麦Protana公司)；QSTAR四极杆飞行时间串联质谱仪(美国AppliedBiosystems公司)；Mini—Cell垂直电泳仪(美国Bio—Rad公司)；GS800扫描仪(美国Bio—Rad公司)。乙腈和甲醇(HPLC级，Fisher公司)；测序级胰蛋白酶(Promega公司)；抗烯醇化酶1和抗溶菌酶c的单克隆抗体(SantaCruz

6、公司)；BCA蛋白检测试剂盒(PierceChemicals公司)；A型禽流感病毒H5N1(AvianinfluenzavirusA／Chicken／HongKong／YU22／2002)，在III级生物安全实验室(BL-3)中进行培养。2011—06-08收稿；2011—10-25接受本文系国家自然科学基金(No．21175055)、吉林省科技厅(Nos．20090952，20110739，20110731)和吉林大学基本科研业务费(Nos450060445316，45OO60326056)资助。E-mail：zhouqw@jlu．edu．cn，liuni

7、ng@jlu．edu．ca第3期王志武等：禽流感H5N1病毒颗粒中鸡胚宿主蛋白的质谱分析3772．2病毒培养和离心纯化将A型禽流感病毒H5N1接种于鸡胚中，在35℃条件下孵育72h，收集尿囊液；用0．03％福尔马林在4℃灭活72h；将含有病毒的尿囊液以5000r／min离心15min，收集上清液。所有对活病毒进行的实验操作均在三级生物安全实验室完成。将上述含有灭活病毒的上清液在4℃以40000r／min离心1h，弃去上清液，沉淀悬浮于含有10mmol／LTris—HC1(pH8．0)、150mmol／LNaC1和25mmol／L巯基乙醇的缓冲液中。取适量病毒

8、悬液，加入到20％～60％(w／w)蔗糖梯度溶液液面