基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法区分大肠杆菌糖基转移酶基因.pdf

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1、第39卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究简报第1期2011年1月ChineseJournalofAnalyticalChemistry99～1O2DOI：10．3724／SP．J．1096．2011．00099基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法区分大肠杆菌糖基转移酶基因周大炜1,2,3刘斌1,2,3吴俊丽1,2,3胡波齐源远(南开大学泰达生物技术学院，天津市微生物功能基因组学重点实验室，南开大学分子微生物学与技术教育部重点实验室，天津300457)摘要采用高能碰撞诱导解离(cID)一负离子模式基质辅助激光解吸离子化一飞行时间质谱技术(MALDITOFMS)区别wfg

2、D(大肠杆菌O152中O抗原基因簇内)编码的1，3葡萄糖转移酶和wfgD(大肠杆菌077中0抗原基因簇内)编码的a一1，3一甘露糖转移酶酶促反应产物一两个脂寡糖非对应异构体。结果表明：由高能CID—MALDITOF质谱图中产物离子[B，】／[Y]丰度比率的差别可明确区别两个酶促反应产物。并发现碰撞能量为1．0kV时，碰撞靶气的压力变化可影响产物离子[B】／[Y，]的丰度比率。推断MALDI—TOF质谱图中，两个脂寡糖非对应异构体的磷酸二脂键部分和糖苷键的裂解依赖于糖基给予体的立体化学。关键词脂寡糖；糖基转移酶；基质辅助激光解吸离子化一飞行时间质谱引言0抗原是革兰氏阴性菌外

3、膜的重要成分，也是免疫系统和抗菌素的主要靶点，0抗原的多样性对于细菌的致病性及在宿主体内的生存有重要作用】。O抗原由寡糖重复单位组成，每个重复单位通常由2～8个单糖组成，()_抗原的多样性主要源于构成重复单位的单糖种类和糖苷键链接方式的不同。在0一抗原生物合成过程中，糖基转移酶负责将核苷二磷酸单糖前体上的糖基转移到延伸中的寡糖单位。尽管糖基转移酶非常重要，但由于编码此类酶的基因之间的同源性很小，根据与其它已知基因的比较，只能判断一个未知基因是否属于这类基因，不能判断其合成的糖苷键类别。目前，糖基转移酶基因功能的明确鉴定主要依赖酶促反应产物化学结构的正确表征。大部分糖基转移

4、酶酶促反应产物属于脂寡糖非对映异构体，由于脂寡糖非对映异构体鉴定和区分的困难，在纯化制备酶促反应产物的基础上，应用核磁共振(NMR)技术仅能明确鉴定少部分假定糖基转移酶的特定功能B。理论上，一维和二维NMR技术是现有测定糖链结构最常用的方法，也是区分脂寡糖非对映异构体的最有效途径。但其主要缺点是灵敏度较低，特别是涉及耗时繁琐的分离纯化制备步骤。近年来，基质辅助激光解吸离子化方式的发展和成熟为寡糖非对映异构体的区分提供了技术平台1。本研究在采用NMR技术已证明其基因功能的基础上，以wfgD编码的1，3一葡萄糖转移酶和wfgD编码的a一1，3一甘露糖转移酶酶促反应产物——两个

5、脂寡糖非对应异构体为研究对象，采用高能碰撞诱导解离(CID)一负离子模式基质辅助激光解吸离子化一飞行时间质谱技术(MALDI-TOF—MS)，对两个脂寡糖非对映异构体进行了区分。2实验部分2．1仪器与试剂MALDI—TOF—MS基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪(4700AppliedBiosystems，MA)。甲醇和乙腈(色谱纯，Fisher公司)，a一氰基一4一羟基肉桂酸(a—CHCA，Fluka公司)，UDP—Glc和GDP—Man(Sigma-Aldrich公司)，水为二次蒸馏水。本实验涉及的菌株、质粒、酶及其它生化试剂参见文献[2]。2010-04-28收稿；

6、201f1卜07接受本文系南开大学引进人才科研启动资金(No．J02006)资助E-mail：daweizhou@nankai．edu．cn1OO分析化学第39卷2．2样品制备大肠杆菌077抗原中wfgD基因和O152抗原中wfgD基因的克隆、含重组质粒的细菌培养及酶活反应细胞膜提取物的制备按文献[2仂法进行。由于wfgD和wfgD与细胞膜之间存在相互作用，本研究以H1517(含wfgD或wfgD基因的重组质粒)的细胞膜部分作为酶的来源进行酶促反应。标准4OL反应体系为：1．0mmol／L受体GlcNAc—PP—PhU(空白对照以二次蒸馏水替代)，5mmol／LMnC12

7、，75mmol／LMES缓冲液(pH7)，5mmol／LGDP—Man(或UDP—Glc)和10L细菌膜提取物(含1．0～12gProtein，阴性对照分别以大肠杆菌DH5a和BL21替代)。37℃水浴中反应10min后，沸水浴中加热1min，12000r／min离心5min。将上清稀释200倍后，取0I3待测液与等体积基质，滴于样品探头靶心，室温干燥结晶后直接分析测试。wfgD酶促反应产物(Glc—D—l，3一GalNAc一一PO3-PO3一(CH2)11一OPh)和wfgD酶促反应产物(Man-ct一1,3一GalNAc-