基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱法分析人乳β-酪蛋白新生儿体外消化模型多肽组.pdf

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1、第43卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第5期2015年5月ChineseJournalofAnalyticalChemistry631—636DOI：10．11895／j．issn．0253~820．1500012研究报告《石；石＼基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱法分析人乳一酪蛋白新生儿体外消化模型多肽组李相怡方曦任皓威程琳张拓4付国红刘宁1,2,3(国家乳业工程技术研究中心，黑龙江省乳品工业技术开发中心，哈尔滨150028)(东北农业大学食品学院，乳品科学教育部重点实验室，哈尔滨150030)(食品安全与营养协同创新中心，

2、哈尔滨150028)(北京蛋白质组学研究中心，北京102206)摘要通过体外模拟新生儿消化道条件，用基质辅助激光解吸离子化飞行时间串联质谱法(MALDI．TOF／TOF)探究人乳卢．酪蛋白消化后的多肽组。在离子源加速电压为20kv，激光波长337nm，激光频率200Hz，离子延迟提取时间330as，质谱信号单次扫描累加2000次条件下，扫描质量范围m／z500～5000的肽段。结果表明，消化后得到26个肽段，分子量集中在1000～4000Da。与已知功能的肽段序列进行对比，人乳一酪蛋白在新生儿体外模型消化后未产生与已知功能的活性肽序列匹配的

3、肽段。但发现9个肽前体，其中含4个血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽前体，2个酪蛋白磷酸肽(CPP)前体，2个抗氧化肽前体，1个免疫活性肽前体，由酶切位点推测分析，肽前体可以继续在蛋白酶作用下转化为生物活性肽关键词一酪蛋白；新生儿；体外消化；多肽组；基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱1引言多肽组(Peptidome)是指器官、组织、细胞和体液中全部内源性多肽组分，包括生物体内具有特殊功能的活性多肽和蛋白质代谢产生的多肽¨1]，多肽组学(peptidomics)研究的是多肽组的成分、功能、变化规律及其相关关系[2]，已应用于人体体液多肽组分析

4、_4I5]。人乳以富含多种优质蛋白质以及活性肽等优点被公认是新生儿最好的食品，其中／3．酪蛋白的含量为30％～35％_6础]，是人乳中比重最大的酪蛋白_9，加]。本课题组在人乳卢一酪蛋白(尤其是中国人乳卢．酪蛋白)的鉴定和结构功能方面已开展了前期研究_1卜”j。目前，关于人乳一酪蛋白的研究集中于对其消化产物的分离、鉴定和生物学功能方面l1，还没有针对人乳一酪蛋白消化后多肽组学的报道，而研究人乳．酪蛋白消化后的多肽组可以为日后研发更适合婴幼儿的配方食品提供参考。婴儿(≤12月龄)尤其是新生儿(≤28日龄)的消化系统尚未发育成熟，代谢旺盛，但蛋

5、白酶活性很低，胃蛋白酶活性和分泌量与婴儿生长发育的时间成正相关，而胰蛋白酶的活性以及分泌量在324月龄时也低于成年人[18,19]。本研究在普遍使用的婴儿体外消化方法20]基础上．根据新生儿蛋白酶活性低的特点，建立了更适合研究新生儿体外消化的模型。以此模型消化人乳一酪蛋白，用基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱法分析其消化产物多肽组。2实验部分2．1仪器与试剂GL．21M高速冷冻离心机(上海离心机械研究所)；Delta320型pH计和AL204精密电子天平(瑞士梅特勒．托利多有限公司)；真空冷冻干燥机(上海医用仪器厂)；DYY．IOC型电泳

6、仪和转膜仪(北京六一仪器)；凝胶成像系统(美国Bio—RAD公司)；蛋白质纯化仪AKTApurifer100(美国GE公司)；AB4700MALDITOF／TOF串联质谱仪(美国AppliedBiosystems公司)。2015-01-02收稿：2015-03．10接受本文系”十二五”国家科技支撑计划课题(No．2011BAD09B03)资助E-mail：renhw800903@126．com，ningliuneau@outlook．com李相怡等：基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱法分析第5期人乳口一酪蛋白新生儿体外消化模型多肽组633

7、性分析，结果如图1B和1C所示，确定第5个峰为人乳．酪蛋白。3．2体外模拟新生JLli4化的多肽组分析婴儿处于第一个生长高峰期，生长发育迅速；尤其新生儿期(0—28天)生长发育更快，其消化系统有别于>1月龄的婴儿_l。为此有必要建立新生儿体外消化模型。本研究对目前普遍使用的婴儿体外消化方法I20]进行了改良。分别模拟新生儿胃、小肠以及胃肠连续消化，人乳．酪蛋白被消化成分子量大小不等的肽段，得到的质谱图如图2所示。A罱一、。一g2、；：一￡嚣．eq囊nd-岂Hh。．-I．1l)91302210529083711454m，．、B％i一§≤高-_

8、量一Il。II．J{J4，n／11：C§旨§一童蕊磊蓬。．．i．4图2人乳口一酪蛋白酶消化产物MALDI—TOF检测结果Fig．2ResultsofMALDI—TOFforthe