AKTA蛋白纯化系统操作.doc

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1、AKTA蛋白纯化系统操作AKTA蛋白纯化系统是当前蛋白纯化工作经常用到的一组设备，自动化程度很高。AKTA系统依据不同的配置，可以分为AKTAEXPLORER、AKTAPILOT、AKTAPURIFIER等多种型号的设备。以下以AKTAEXPLORER为例简单介绍AKTA蛋白纯化系统的一般操作。1、认识AKTA。AKTAexplorer是为方法开拓及研究应用而设计的全自动液相色谱系统。该色谱系统的分离装置有三个主要组件，在底部平台的左侧整齐堆起（Fig1）。它们是：FIG1、AKTAEXPLORER主机•Pump-900为双通道高效梯度泵系列。在AKTAexplorer100，

2、流速范围0.01-100ml/min，压力高达10Mpa（泵名为P-901）。在AKTAexplore10，流速范围0.001-10ml/min，压力高达25Mpa（泵名为P-903）。•MonitorUV-900，同时监控190－700nm范围内高达3个波长的多波长紫外-可见（UV-Vis）监测器。（针对部分AKTAPURIFIER机型，尚有UPC-900监测器可供选择，光源为汞灯光源，一次可以监控一个波长，安装滤光片后，可以在选择的波长范围内进行切换。）•MonitorpH/C-900，在线电导和pH监测的组合监测器。Fig2、AKTAEXPLORER硬件模式图AKTAEX

3、PLORER系统的主要组成部件可以用模式图表示（Fig2）。组成部件，如混合器、柱及不同的阀安装在右边部分。打开装阀的门可全部看到。柱被挂在装阀的门的外侧。分离装置由UNICORN软件控制。软件安装于一独立的电脑主机之中，在电脑与色谱系统之间的通信由数据采集装置CU950进行控制。2、一般操作2.1开机按位于底部平台前左侧的ON/OFF按钮，打开色谱系统，然后打开电脑电源。待仪器自检完毕（CU950上面的3个指示灯完全点亮并不闪烁）。双击桌面上UNICORN图标，进入操作界面。UNICORN的操作界面分为四个窗口（Fig3）Fig3、Unicorn的操作界面2.2准备工作溶液和

4、样品所有的工作溶液和样品必须经过0.45µm的滤膜过滤，样品也可高速离心后取上清备用。当缓冲液中含有有机溶剂（如乙腈、甲醇），需在使用前用低频超声脱气10min。2.3清洗及管道准备首先将A泵的进液管道（A1）放入缓冲液或平衡液中，将B泵的进液管道(B1)放入高盐溶液中，在systemcontrol窗口点击工具栏内的manual，选择pump→pumpwashexplorer，选中A1,B1管道为ON，execute。泵清洗将自动结束。(Fig4)Fig4、AKTAExplorer的泵清洗操作2.4安装层析柱在manual里选择pump→flowrate，输入一定的低流速（Fi

5、g5），insert；选择Alarm&mon→alarmpressure，设置highalarm（输入填料或层析柱的耐受压力，以较低者为设置值，具体可在填料说明书或层析柱说明书中查到），insert，execute（Fig6）。待InjectionValve的1号位管道流出水后接入柱子的柱头，稍微拧紧后将柱下端的堵头卸掉接入管道连上紫外流动池。Fig5、AKTAExplorer的流速设定操作Fig6、AKTAExplorer的限压设定操作2.5开始纯化：1）在柱子平衡好之后（电导，pH的数值和变化趋势稳定）即开始上样了。此时应将紫外调零（Fig7），选择Alarm&mon→au

6、tozero，exectue。Fig7、AKTAExplorer的紫外调零操作2）具体上样方式：AKTA系统的上样方式比较灵活，可以根据具体样品的条件进行上样，包括用样品环上样、用系统泵上样、用样品泵上样等，这里以用系统泵上样为例简单介绍上样过程。点击pause，将A1放入样品中，点击countine，待样品上完后，再将A1放入到平衡液中继续清洗柱子。3）洗脱：上样后用缓冲液尽量将穿透峰洗回基线。在manual里选择pump→gradient，按照自己的工艺选择targetB（100％）和length（10CV）（Fig8）。Fig8、AKTAExplorer的洗脱条件设定操作

7、4）设定收集：选择Frac→fractionation_900,输入每管收集体积，exectue（Fig9）。结束固定体积收集选择Frac→fractionation_stop_900，exectue（Fig10）。Fig9、AKTAExplorer的组分收集设定操作Fig10、AKTAExplorer的组分收集停止设定操作5）清洗泵及卸下层析柱：将A1和B1入口放入纯水中，启动pumpwashpurifier功能冲洗A泵和B泵及整个管路。然后再将A1和B1入口放入20％乙醇中，同样操作将乙