蛋白纯化AKTA操作说明.doc

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1、AKTApure操作说明分子筛层析操作步骤：1.开机：打开AKTApure开关，看指示灯，泵同步（泵内有注入液体的声音）。2.打开系统：打开电脑：双击Unicorn7.0打开系统，进入logon界面，用户名默认为Default，输入密码：default，点ok键，出现提示对话框，继续点确定，进入系统。注意：进入系统时会弹出三个界面：SystemControl界面，Evaluation界面和Administration界面。其中systemControl界面为主操作窗口，所有的设置选项都是在该界面下完成：Manual---ExecuteManualins

2、tructions---......；Evaluation界面为结果数据查看及处理窗口；Administration界面为Unicorn7.0系统设置界面。3.洗泵：把A1泵头从20%乙醇中取出，用去离子水冲洗，放入分子筛缓冲液中，在SystemControl界面下，点击manual---ExecuteManualinstructions---Pumps---PumpAwash---点开inlet，选择A1---Excuse。4.设置系统参数：设柱压：Alams---alamsystermpressure---highalam---设置柱压---Exe

3、cute；设流速：Pumps---Systemflow---设置systemflow（1mL/min）---Execute。注意：流速和柱压设置参照“GE蛋白纯化柱表”，不要超出最高限制。5.装柱子(先上后下)：接柱子的上面：拧下连接进样阀和检测器之间的线，等进样阀出口有液体流出时，拧开柱上面线头的螺帽，将它连到进样阀出口；接柱子的下面：去掉柱下端连接的注射器，连上接头，连上一段线，待液体滴出滴出液体滴到检测器上的连接口的洞里，滴满，将接头连到检测器的连接口里。6.平衡柱子：分子筛buffer平衡柱子，一般要两个小时左右，盐离子浓度达到5.5%左右。7

4、.设置系统及收集参数：命名：先end---Manualinstructions，点击browse，弹出selectresultname&location界面，点开文件夹“defaultHome”，找到文件夹“labdata”，点开，选择自己名字首字母缩写文件夹(已创建)，在界面下方“name”指令框进行命名。注意：命名时要标明日期，柱子型号，样品名称。设流速：Pumps---Systemflow---设流速（1mL/min）---Execute；设柱压：Alams---alamsystermpressure---highalam---设置柱压---点击

5、Execute；洗A泵：Pumps---PumpAwash---点开inlet，选择A1---Excuse；紫外调零：Monitors---AutozeroUV---Execute；设置收集体积：Fractoncollection---peakfractionation---fractionsize---设置收集体积---Execute；一般设为1mL(可根据实际情况调整)。设置收集水平：Fractoncollection---peakfractionationparameters---Startlevel---设置起始收集水平---Execute。注

6、意：对于初次纯化的蛋白，由于蛋白含量未知，起始水平可设低些，如10mAU,避免损失蛋白。8.上样：冲洗Loop环：取5mL注射器，吸取5mL分子筛（不能有气泡），从进样口注射2倍Loop体积的分子筛来清洗Loop环；蛋白样品处理：取出蛋白样品（<2mL），12000rpm离心3min，把上清转移至新的离心管管，重复一次，以去除沉淀，避免堵塞系统；手动蛋白上样：把蛋白样品转移至注射器内，从进样口把样品注射入Loop环内；注意：上样时应小心操作，首先弹出注射器内的气泡，随后稍推注射器，使注射器出口处悬挂一样品液滴（别太用力，导致液滴滴落），然后把注射器插入

7、进样口，把蛋白样品推入Loop环中。Inject:点击Flowpath---injectionvalve---点开position选项---inject---Execute---走2倍Loop体积的分子筛缓冲液；Load:点击Flowpath---injectionvalve---点开position选项---manualload---Execute，调回Load状态。9.收集目标蛋白：参照标准蛋白曲线，估计样品出峰位置，收集蛋白样品，做好标记，过完后，peakfracstop900停止收集。10.20%乙醇平衡柱子：等精氨酸峰出来，离子浓度平衡后，点

8、击pause，进分子筛的buffer的泵头用去离子水洗，放入20%的乙醇中，continue-