细菌内毒素检查结果准确性的影响因素.ppt

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1、细菌内毒素检查结果准确性的影响因素一、试验误差分析及改进措施鲎试剂质量及灵敏度标示值得的影响细菌内毒素工作标准品效价及使用的影响实验器皿的的影响样品成份及理化性质的影响实验员的影响环境的影响1鲎试剂质量及灵敏度标示值得的影响鲎试剂的质量：抗干扰能力，稳定性；鲎试剂灵敏度标示值的准确性。鲎试剂灵敏度的误差是否用细菌内毒素国家标准品标定？标示值是否准确？2细菌内毒素标准品引起的误差细菌内毒素标准品种类细菌内毒素标准品效价误差细菌内毒素标准品操作误差细菌内毒素单位表示误差细菌内毒素标准品的错误使用1）细菌内毒素标准品种类细菌内毒素国际标准品细菌内毒素国家标准品细菌内毒素工

2、作标准品2）细菌内毒素标准品效价误差细菌内毒素国家标准品与细菌内毒素工作标准品之间或细菌内毒素工作标准品与细菌内毒素工作标准品之间的生物效价存在一定的误差，用不同细菌内毒素标准品复核同一批鲎试剂灵敏度时可能存在一定的误差。中国药典要求“当λc在0.5λ-2λ(包括0.5λ和2λ)时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。”试验结果只要在这合格范围内表示鲎试剂标示灵敏度准确。3）内毒素标准品操作误差取细菌内毒素工作标准一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，再用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，用75%酒精棉球擦拭后启开，防止玻璃屑落入瓶内。正确（易折点）错误注

3、意：①只能在安瓿的易折点上部开启内毒素，不能沿易折点开启，防止振荡过程中内毒素粘在封口膜上。②只能取1ml的细菌内毒素检查用水复溶细菌内毒素工作标准品。③若使用的为细菌内毒素国家标准品，可按其使用说明书中的方法将其稀释至规定浓度后分装保存。若为细菌内毒素工作标准品，为一次性使用。4）错误使用有部分客户使用厂家生产的细菌内毒素来复核鲎试剂的灵敏度，这是一种错误行为，更有甚者使用厂家生产的细菌内毒素来交叉复核鲎试剂的灵敏度，这是一种严重错误行为。3实验器皿的影响器皿的计量管理（校正）器皿的选择标准器皿的正确处理1）器皿的选择标准鲎试验对器皿的要求：刻度准确；内表面光滑；

4、易于清理。细菌内毒素检查实验不宜选用注射器，最好使用经过校正的刻度玻璃吸管或吸嘴。注射器刻度不精确，内壁磨沙面吸附内毒素，而且要特别注意注射器针头引入的铁离子对试验结果的干扰，故不宜选用注射器。如果用量不大，使用频率不高，建议大家选用本公司提供的一次性耗材。无热原耗材是一种在此行业中被鉴定为无内毒素和β-葡聚糖污染的产品，其中包括,无热原试管、无热原移液器吸头。这些产品可以给您的工作带来很大方便,另外，当实验出现误差时可首先排除器皿方面的因素,很快分析判断出误差原因。2）器皿的正确处理2005年版《中国药品检验标准操作规范》278页——细菌内毒素检查法“实验准备”规

5、定：“将被洗涤的玻璃器皿用洗涤剂和自来水洗净并烘干水分后，置洗液中浸泡4小时，取出将洗液沥干，用自来水将残余的洗液洗净，再用蒸馏水冲洗干燥后置适宜的密闭金属容器中，迅速置烤箱中，除去玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒素。”应该特别注意，该规程明确规定最后冲洗玻璃器皿必须“用蒸馏水冲洗，禁用纯化水冲洗。”有的客户使用反渗透制备的纯化水冲洗试验用玻璃器皿，结果试验中所有的阳性对照都为阴性，复核鲎试剂灵敏度时试验结果误差较大，这主要是由于纯化水和蒸馏水的质量不同所造成的。因纯化水中存在的阴阳离子经250℃高温干烤不能完全被破坏，这时不同的离子就产生对鲎试剂酶反应抑制或增强的

6、反应，为了保证试验结果的准确性和检验报告的权威性，我们应该严格遵守操作规程，用多效蒸馏水冲洗鲎试验用玻璃器皿。4样品成份及理化性质的影响β-葡聚糖样物质的影响PH值的影响金属离子和弱酸阴离子的影响药物浓度的影响1）β-葡聚糖样物质的影响常见现象：假阳性。鲎试剂的特异性系指在药品、生物制品和血液制品中鲎试剂能准确测出被测物质内毒素的能力，既不能造成样品内毒素的漏检，也不能将其它物质错判为内毒素。目前我公司研究证明，已知能与鲎试剂发生反应的物质有细菌内毒素和β-葡聚糖，而内毒素反应曲线为S型特征曲线，β-葡聚糖反应曲线为经过0点的斜线。鲎试剂的特异性差的另一种表现，是将

7、其它物质（如β-葡聚糖）判定为内毒素，错误将合格药品判为不合格，造成制药厂直接经济损失。鲎试剂反应机理图判断假阳性的方法：1、特异性鲎试剂法；2、定量反应曲线分析法；3、家兔模拟试验法。2）PH值对反应速度的影响常见现象：样品阳性不成立。鲎试剂与内毒素反应的最适宜pH在6.5-8.0；pH≤3或≥10时，酶活性受到抑制。相对活力PH7.0PH对反应速度的影响:影响酶原的激活；影响酶分子的构象，过高过低的PH会改变酶的活性中心的构象，或甚至改变整个酶分子的机构使其变性失活。故鲎试验时，供试品pH最好应预调和6.5-8.0为好，必要时可用无内毒素的HCl或NaOH稀