免疫组化的原理与操作.ppt

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1、免疫组织化学Immunohistochemistry概念：免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)是利用抗原抗体反应和组织化学呈色反应来检测组织和细胞中某种化学成分的一门技术,是传统的免疫学和组织化学相结合而发展起来的一门新兴学科，也叫原位免疫学（Insituimmunology）。特点或优点：（1）特异性强、灵敏度高；（2）可定性、定位、定量观察；（3）将形态学改变与功能和代谢变化结合起来；免疫组化概述IHC不仅具有传统形态学（包括LM和EM水平）能对组织和细胞进行仔细、客观观察的优点（特别是经苏木精或伊红复染后），

2、而且还克服了传统免疫学反应只能定性和定量（离体、液相），而不能定位的缺点。IHC则可在原位和固相对染色结果进行观察。目前IHC的定位可精确到亚微结构水平。随着IHC技术的发展和图象分析技术的发展，IHC已进入多标记（双标记）和定量研究的阶段，使IHC在生物学和医学各领域的应用日益广泛，不仅用于研究，也用于诊断。IHC与核酸分子杂交相结合形成的原位杂交技术（insituhybridization，ISH）既特异性强、灵敏，又具定位、可视的特点。——IHC技术源于免疫荧光术（immunofluorescence,IF），从1941年~1950年C

3、oons等用了10年首创了荧光素标记抗体技术——检测肺组织内的肺炎双球菌，六、七十年代IF在科研中占据着主导地位——1968年中根一穗（Nakane）等创建了酶标抗体技术（immunoperoxidase，IPO）——铁蛋白标记Ab技术;——1974年Stemberger改良上述技术，建立辣根过氧化物酶－抗体过氧化物酶（PAP）技术，使免疫细胞化学得到广泛应用；一、IHC的发展简史——80年代Hsu等建立了ABC法之后，免疫金—银染色法、半抗原标记法、免疫电镜技术相继问世。——90年代分子杂交技术、原位杂交技术、免疫细胞化学分类方法迅速发展；

4、——2000年各种免疫组化技术更加成熟，使免疫组化技术成为当今生物医学中形态、功能代谢综合研究的一项有力工具。其应用范围深达医学各个学科，是目前生命科学工作者应该掌握的基本技术之一；——国内起步晚，从70s开始。（一）方法学1.从传统的抗原、抗体反应（免疫反应）→亲和反应。新的亲和物质对有：生物素与卵白素（biotin&avidin)，葡萄球菌A蛋白（SPA）与IgG，凝集素与受体，激素与受体。这些亲和对亲和力强，且可与多种标记物（荧光素、酶、同位素、胶体金、铁蛋白等）结合，由此产生了亲和组织化学（affinityhistochemistry

5、），这些方法特异性、敏感性、稳定性高，更方便、适于某些特殊观察（如EM）。2.从单一显示某种物质（单标记）→显示多种物质（双标记）。3.从LM→EM（超微结构）：免疫电镜、胶体金法、金银法。4.从定性→定量，图象分析（IA）、流式细胞术（FCM）。5.IHC与ISH相结合，可在不同水平检测DNA、mRNA、protein。6.原位PCR+IHC可在组织原位通过扩增检测微量目的DNA。7.趋于标准化、自动化。二、IHC的现状和发展前景（二）技术分类1.根据染色方式分成：①贴片染色②漂浮染色2.根据Ag-Ab结合方式分成：①直接法②间接法③多层法

6、3.按标记物的性质分成：①免疫荧光技术（免疫荧光法）②免疫酶技术（酶标抗体法、桥法、PAD法、ABC法）③免疫金属技术（免疫铁蛋白法、免疫金染色法、蛋白A金法）（三）标记物1.必要性：组织细胞内Ag-Ab结合反应一般是不可见的，若在镜下检测，则必须具有可视性标记物。2.常用标记物①荧光素：最常用的是异硫一氰酸荧光素（Fluoresceinisothiocyanate，FITC）---荧光显微镜下呈绿色荧光;四乙基罗达明（rho—damineRB200）---荧光显微镜下发橙红色荧光②酶：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶。③生物素：（Biotin）④

7、铁蛋白金等：主要应用于免疫电镜。⑤其他：如同位素（因涉及污染和防护难一般不用）（四）IHC的应用1.只要是形态科学均可采用:包括病理学、神经科学、生物学、病原微生物的检测（病毒、细菌、寄生虫等）、皮肤病学、器官移植等。2.可用于多种材料：A.各种组织（冰冻组织、formalin固定组织、石蜡包埋组织兼可）；B.各种细胞(穿刺、体液、涂片、血细胞、培养细胞等）。3.用于诊断：肿瘤病理学等（大中医院）。4.用于科研：临床和基础医学，尤其是形态学专业研究生常用IHC，或IHC+分生技术；最近几年，分子生物学研究异常活跃，但最终还要归到形态上来，用免

8、疫组织化学方法对所研究的大分子进行定位，进而深入研究其功能。（一）标本的收集与处理IHC染色成功与否及其质量如何，除染色方法本身外，对材料的处理也至关重要，它包括：