免疫组化操作规程

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1、免疫组化操作规程（一）、仪器设备  1）18cm不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉；  2）水浴锅（二）、试剂  1）PBS缓冲液（pH7.2～7.4）：NaCl137mmol/L，KCl2.7mmol/L，Na2HPO44.3mmol/L，KH2PO41.4mmol/L。  2）0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CB，pH6.0，1000ml）：柠檬酸三钠3g，柠檬酸0.4g。  3）0.5mol/LEDTA缓冲液（pH8.0）：700ml水中溶解186.1gEDTA·2H2O，用10mmol/LNaOH调至pH8.0,加水至100

2、0ml。  4）1mol/L的TBS缓冲液（pH8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至pH8.0,加水至1000ml。  5）酶消化液：a、0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCl2(pH7.8)配制。b、0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。  6）3%甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。  7）封裱剂：  a、甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9.0～9.5）等量混合；  b、油和TBS(或PBS)配制。   8）TBS/PBSpH9.0～9.5，适用于荧光显微镜

3、标本；pH7.0～7.4适合于光学显微镜标本。（三）、操作流程  1、脱蜡和水化  脱蜡前，应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。  1）组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟；  2）无水乙醇中浸泡5分钟；  3）95%乙醇中浸泡5分钟；  4）70%乙醇中浸泡5分钟；  2、抗原修复 用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片。 1）抗原热修复 （1）高压热修复在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）。盖上不锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。将玻片置于金属

4、染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡5分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10分钟后，去除热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。 （2）煮沸热修复电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10~15分钟。 （3）微波热修复在微波炉里加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5~10分钟，反复1-2次。适用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cad

5、herin，ChromograninA，Cyclin，ER，Heatshockprotein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，TopoismeraseⅡ等。 2）酶消化方法常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热至37℃，切片也预热至37℃，消化时间约为5~30分钟；胃蛋白酶消化37℃时间为30分钟。适用于被固定遮避的抗原，其中有：Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GF

6、AP，LCA，LN等。  3、免疫组织化学染色  SP法  1）脱蜡、水化；11  2）PBS洗2～3次各5分钟；  3）3%H2O2（80%甲醇）滴加在TMA上，室温静置10分钟；  4）PBS洗2～3次各5分钟；  5）抗原修复；  6）PBS洗2～3次各5分钟；  7）滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟。甩去多余液体。  8）滴加Ⅰ抗50μl，室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。  9）4℃过夜后需在37℃复温45分钟。  10）PBS洗3次各5分钟；  11）滴加Ⅱ抗40～50μl，室温静置，或37℃1小时；  

7、12）II抗中可加入0.05%的tween-20。  13）PBS洗3次各5分钟；  14）DAB显色5～10分钟，在显微镜下掌握染色程度；  15）PBS或自来水冲洗10分钟；  16）苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化；  17）自来水冲洗10～15分钟；  18）脱水、透明、封片、镜检。  SABC法  1)脱蜡、水化。  2)PBS洗两次各5分钟。  3)用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2，室温封闭5～10分钟，蒸馏水洗3次。  4)抗原修复。  5)PBS洗5分钟。  6)滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。甩去多余液

8、体。  7)滴加Ⅰ抗,室温1小时或者4℃过夜或者37℃1小时（4℃过夜后在37℃复温45分钟）。  8)PBS洗三次每次2分钟。  9)滴加生物素化二抗,20℃～37℃20分钟。  10)PBC洗3次每次2分钟。  11)滴加试剂SABC，20℃～