免疫组化各步原理

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1、一、免疫组化技术免疫组织化学（Immunohistochemistry;IHC）技术是用标记的特异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行组织和细胞原位检测技术。目前，这种技术在临床病理诊断和形态学研究中已得到广泛应用。Slide3:（一）、免疫组化常用染色方法和步骤（石蜡切片）SP法（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法）:SP法（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法）原理采用生物素标记的第二抗体与链霉菌抗生物素蛋白连接的过氧化物酶及底物色素混合液来测定细胞和组织中的抗原。主要步骤:主要步骤1、石蜡切片脱蜡（与常规HE切片脱蜡相同）：石蜡切片置60℃烤箱烤片15

2、小时以上→从烤箱中拿出立即放入二甲苯Ⅰ中5~10min→二甲苯Ⅱ5~10min→无水乙醇5min→95%乙醇5min→80%乙醇5min→70%乙醇5min→自来水洗Slide6:2、3%H2O2阻断20min（以消除内源性过氧化物酶的活性，降低背景）；PBS洗3次，每次5min。3、抗原修复；PBS洗3次，每次5min。4、滴加5~10%正常山羊血清封闭，37℃,10min(消除背景非特异性着色)Slide7:5、吸干组织周围多余的血清，不洗，滴加第一抗体，37℃,孵育60min或孵育30min再4℃冰箱过夜；PBS洗3次，每次5min。6、擦干组织周围PBS，滴加生物

3、素标记的第二抗体，37℃,孵育20min，PBS洗3次，每次5min。Slide8:7、擦干组织周围PBS，滴加链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液37℃,孵育20min。8、PBS洗3次，每次5min，D.W洗2次，DAB显色(DAB必须现用现配)，镜下控制显色程度，自来水冲洗，苏木素复染胞核，烤干，中性树胶封片。染色步骤:染色步骤石蜡切片脱蜡到水；3%H2O2阻断10min（以消除内源性过氧化物酶的活性，降低背景）；蒸馏水洗2次，PBS洗3次，每次5min。抗原修复；PBS洗3次，每次5min；Slide11:滴加第一抗体，37℃孵育60min或37℃孵育30min再4℃冰

4、箱过夜；PBS洗3次，每次3min。擦干组织周围PBS，滴加酶标抗鼠/兔聚合物，37℃,孵育20min。PBS洗3次，每次3min，D.W洗2次，DAB显色，镜下控制，自来水充分冲洗，复染，烤干，中性树胶封片。（四）抗原修复:（四）抗原修复目的：1、甲醛固定过程中形成醛键而封闭部分抗原决定簇；2、甲醛在保存过程中会形成羧甲基而封闭部分抗原决簇；3、固定剂固定组织时，会使组织中蛋白与蛋白之间发生交联，也可能封闭抗原决定簇。4、抗原决定簇被封闭之后,会影响抗原抗体的结合,因此在染色时需先进行抗原修复，通过抗原修复，充分暴露抗原决定簇。使抗原抗体得以充分结合。Slide15:抗

5、原修复的作用机理是1、抗原修复液中的化学物质分子或离子与部分抗原决定族结合产生化学反应，增加了细胞和组织的通透性，便于抗原抗体的充分结合。2、高温可以使某些已封闭的抗原决定族得以重新暴露和修复。3、微波是一种高频电磁波，可打开蛋白质之间的交联键，从而使抗原修复。Slide16:抗原修复注意事项:抗原修复注意事项1、应根据不同的抗原选择合适的修复方法。2、热处理后应注意自然冷却，酶消化后要洗干净。3、防止切片干燥，特别是热修复时要防止修复液蒸发而使切片干燥。Slide22:4、注意形态学结构的改变和脱片问题：酶消化浓度过高，时间过长、温度过高都可能导致组织的形态结构改变；热

6、修复时间过长也可能导致形态学结构改变和脱片。Slide23:（五）常用溶液的配制1、0.01MPBS:磷酸二氢钠(NaH2PO4)1.5g磷酸氢二钠(Na2HPO412H2O)14.5g氯化钠42.5g氢氧化钠2粒加蒸馏水5000mlSlide24:2、3%H2O2甲醇450ml30%H2O250ml混匀。Slide25:3、pH值6．0的柠檬酸缓冲液3.1储存液：A液：枸橼酸21.01g蒸馏水1000mlB液：枸橼酸钠29.41g蒸馏水1000mlSlide26:0.1±3.2工作液：A液9mlB液41ml蒸馏水450ml溶液pH值为6.0Slide27:4、胰蛋白酶(

7、0.05%~0.1%)取0.05g或0.1g胰蛋白酶加入到100ml0.1%pH7.8的无水氯化钙水溶液中溶解即可。Slide28:5、胃蛋白酶（0.4%）胃蛋白酶0.4克0.1mol/LHCl100ml*配制好的酶用5ml小瓶分装，保存于冷冻箱，用前拿出来溶解。（六）结果观察(一)胞浆阳性:（六）结果观察(一)胞浆阳性(二)胞核阳性:(二)胞核阳性Slide31:二、常见问题及对策Slide32:由于免疫组化染色过程有许多步骤和环节，每一个步骤和环节都可能影响到染色的最终结果，因此，要做好一张高质量的免疫组化切片并不是一件很