二步法免疫组化步骤.doc

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1、Sp二步法步骤啊,具体如下：一、1烤片，65℃，2小时；二、二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水：二甲苯I20min--二甲苯II20min—无水乙醇I15min–无水乙醇II15min--95%乙醇10min--80%乙醇10min--70%乙醇10min–双蒸水10min三、阻断灭活内源性过氧化物酶：3%H2O237℃孵育10min，PBS冲洗3X5min；四、抗原修复:置0.01M枸橼酸缓冲液（PH6.0）中用煮沸（95℃，15－20min），自然冷却20min以上，至室温，PBS冲洗3X5min。五、正常羊

2、血清工作液封闭，37℃10min，倾去勿洗.六、滴加适当比例稀释的一抗4℃冰箱孵育过夜或37℃孵育2—3小时，PBS冲洗3X5min（用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照）；七、滴加生物素标记的二抗,37℃孵育15min,PBS冲洗3X5min;八、滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，37℃孵育15min,PBS冲洗3X5min;九、DAB显色：1ml双蒸水先加一滴A，混合均匀，再加B和C，再次混匀，三夜混合后，室温反应2—10min，显微镜下观察，有棕黄色沉淀物，即自来水冲洗，终止反应。十、苏木素

3、复染3—5min，盐酸酒精分化1—2s，常规脱水，透明，干燥，封片。