免疫组化基本步骤.doc

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1、细胞免疫组化染色步骤1．细胞爬片，取出后，PBS洗三遍，每次3分钟。4℃冷丙酮固定10分钟，（或用4%多聚甲醛固定30分钟），干燥30分钟。2.用PBS洗三次，每次5分钟，加3%过氧化氢30μl，室温孵育10分钟，（以消除内源性过氧化物酶的活性）蒸馏水冲洗，PBS洗三次，每次5分钟。3．加1%的TritonX-10030μl，室温孵育10分钟，增加细胞膜的通透性。蒸馏水冲洗，PBS洗三次，每次5分钟。4．滴加正常山羊血清30μl，封闭非特异性结合位点，以消除非特异性染色，室温孵育30分钟，倾去勿洗。

2、5．滴加适当稀释度的一抗，空白对照组以PBS代替一抗，4℃湿盒孵育过夜。PBS洗三次，每次5分钟。6．滴加生物素标记的二抗工作液30μl，室温孵育30分钟。PBS洗三次，每次5分钟。7．滴加辣根酶标记链酶卵白素30μl，室温孵育30分钟。PBS洗三次，每次5分钟。8．滴加DAB显色剂30μl，显微镜下观察显色，自来水冲洗。9.将处理好的玻片细胞核衬染：浸入苏木精染液染色2min，自来水洗，迅速过盐酸酒精溶液，自来水洗，过氨水溶液，自来水洗。10.梯度酒精脱水，过70%酒精1次，95%酒精2次，无水乙

3、醇3次，每次1min11.二甲苯透明，过二甲苯溶液3次，每次１min。12.中性树胶封片将有细胞的一面向下，用中性树脂封片。稀盐酸酒精溶液：用75%酒精配制1%盐酸。　淡氨水溶液：在400ml自来水中滴2滴浓氨水(使细胞核蓝化)另外：需1%TritonX-100增加细胞膜通透性。苏木素复染时间和盐酸酒精脱色时间需自己摸索，我是染5-6秒脱色1-2秒。　盐酸酒精还可用70%乙醇配制1%盐酸。　我没用淡氨水溶液。若为悬浮细胞则需涂片，20µl即可。