白鲢p38 MAPK,C-fos,C-jun基因克隆及其微囊藻毒素暴露后的表达分析.pdf

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1、Molecularcloningofp38．?幽—P匠c．=和s，c．I加以andtranscriptionintheliVerandkidneyOfsilVercarpexposedtomicrocystinsADissertationSubmittedtotheGra(1uateSch001ofHenaIlNomalUniVersit)，inPanialFulfillmentoftheRequirementsfortheDe铲eeofMasterofScienceBy三fyk口缈“口门Supervisor：ProfLiXiaoyuMar

2、ch．2015摘要丝裂原活化蛋白激酶(MAP＆)是细胞内重要的信号转导分子，参与生物体多种生理和病理过程的调节。p38MAPK是MApK通路的重要成员之一，它可被细胞内生长因子、细胞因子和胞外多种刺激(环境压力、紫外线、放射线、热休克、炎症因子、特定抗原等)所活化，并参与细胞内多种信号传递过程。原癌基因c于砸、cl“以、c一，掣c属即刻早期基因(ImmediatelyE甜yGenes，IEGs)成员。目前已发现的IEGs有十几种，其中c√瓠、c0“刀基因被广泛用作外界刺激后神经元活化的标记，在细胞活动中起着重要的调控作用。本研究首次克隆了白

3、鲢肝脏印8删，Ⅸ、c扣s和珂删．基因cDNA全长并进行了序列分析，同时检测了微囊藻毒素(MicrocyStins，MC)对自鲢的急性毒性作用及其腹腔注射染毒后自鲢肝脏和肾脏p38删pK、c-加s、巧“n和c．，缈c的表达分析。本研究利用RT．PcR和RACE技术扩增得到p粥M麟、c扣s、c和胛基因的cDNA全序列。序列分析结果表明，白鲢肝脏P粥刎涨基因序列全长2418bp，开放阅读框1086bp，编码361个氨基酸；c扣J基因序列全长为1719bp，开放阅读框1059bp，编码352个氨基酸；巧列腔cDNA全长1931bp，开放阅读框927

4、bp，编码308个氨基酸。生物信息学分析发现，白鲢p38MAPK蛋白相对分子质量为41．64kD，理论等电点为5．54，该蛋白是～个不稳定蛋白．具有较强的亲水性。c．Fos蛋白相对分子质量为38．242kD，理论等电点为4．93，该蛋白是一个不稳定蛋白且具有较强的亲水性。c．Jlul蛋白相对分子质量为33．928kD，理论等电点为9．08，是一个不稳定蛋白且具有一定的亲水性。二级结构预测显示，p38MAPK包含45．71％c【．螺旋、13．02％的延伸链、4．99％的6一折叠和36．29％的无规则卷曲；c—Fos包含25．85％的cc．螺旋

5、、12．78％的延伸链、1．42％的B一折叠和59．94％的无规则卷曲；c．JtHl包含32．14％的oc．螺旋、5，52％的延伸链、1．62％的6．折叠和60．71％的无规则卷曲。对其功能结构位点分析发现，p38MAPK在35～309aa之间存在一个保守的丝氨酸／苏氨酸激酶区；c．Fos和c．Jun分别在108～172aa和227~291aa处有一个典型的亮氨酸拉链结构。通过构建氨基酸系统发育树显示，白鲢p38MAPK与鲤鱼同源性高达96％，白鲢c—Fos与草鱼c—Fos同源性高达97％，白鲢c—Jun与草鱼c—Jun同源性高达95％，与

6、哺乳动物同源性相对较低。另外，qPCR检测结果显示筇8心尸K、c扣J和cl”行在白鲢各个组织均有表达，其中p粥刎麒表达量高低依次是肌肉>肠>脾>肾>鳃>肝>心>脑；c．知表达量高低依次是肝>脾>肾>肠>肌肉>鳃>脑>心；c咖月表达量高低依次是肝>肠>心>脑>脾>肾>肌肉>鳃。通过上下增减剂量法(upanddownprocedure，uDP)对白鲢进行Mc急性毒性实验，结果显示，Mc对白鲢48hLD50为520肛g‘Kg～。根据半致死剂量选取50和200嵋·Kg。1浓度组MC腹腔注射暴露白鲢，分别于1、3、8和12h后取材白鲢肝、。肾组织，提

7、取RNA，通过qPCR检测白鲢p粥删麒、c∞J、c：，“以和c一，缈c基因的表达变化，结果表明，MC对其表达都有明显的诱导作用，推测白鲢p粥刎麒、c一细、c：，“，z和c一优弦可能与MC肝毒性和肾毒性相关。本研究发现，MC可激活白鲢肝脏p38MAPK通路及其下游原癌基因c一加s、c和"、c一，砂c，推测MC诱发肝炎／肝癌可能通过该信号通路介导。该研究结果为深入研究MC诱发肝炎、肝癌的分子机制，寻找Mc毒作用新的分子靶点和肝病防治药物靶点提供理论依据。关键词：白鲢，微囊藻毒素，加8M麒，原癌基因，基因克隆，序列分析，转录ABSTRACTThe

8、mitogen—activatedproteinl(inases似AP＆)arciIl的ceIlularimport狮tsi印almolecul躺andmeyareiIlvolV