白鲢p38 mapk,c-fos,c-jun基因克隆及其微囊藻毒素暴露后的表达分析

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1、单位代码10476学号1204180309分类号Q17硕士学位论文白鲢/c-yw/1基因克隆及其微II藻毒素暴露后的表达分析学科、专业：水生生物学研究方向：水环境毒理学申请学位类别：理学硕士申请人：李园园指导教师：李效宇教授二〇_五年三月本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研宄工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人己经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得河南师范大学或其他教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。关于论文使用授权

2、的说明本人完全了解河南师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权河南师范大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。（保密的学位论文在解密后适用本授权书）Molecularcloningofp38MAPK,c-fos,c-junandtranscriptionintheliverandkidneyofsilvercarpexposedtomicrocystinsADissertationSubmittedtotheGr

3、aduateSchoolofHenanNormalUniversityinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofScienceByLiYuanyuanSupervisor:Prof.LiXiaoyuMarch,2015摘要丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)是细胞内重要的信号转导分子，参与生物体多种生理和病理过程的调节。p38MAPK是MAPK通路的重要成员之一，它可被细胞内生长因子、细胞因子和胞外多种刺激(环境压力、紫外线、放射线、热休克、炎症因子、特定抗原等)所活化，并参与细胞内多种信号传递过

4、程。原癌基因c-fos、c-jun、c-myc属即刻早期基因(ImmediatelyEarlyGenes,IEGs)成员。目前已发现的IEGs有十几种，其中c-fos、c-jun基因被广泛用作外界刺激后神经元活化的标记，在细胞活动中起着重要的调控作用。本研究首次克隆了白鲢肝脏p38MAPK、c-fos和c-jun基因cDNA全长并进行了序列分析，同时检测了微囊藻毒素(Microcystins,MC)对白鲢的急性毒性作用及其腹腔注射染毒后白鲢肝脏和肾脏p38MAPK、c-fos、c-jun和c-myc的表达分析。本研究利用RT-PCR和RACE技术扩增得到p38MAPK

5、、c-fos、c-jun基因的cDNA全序列。序列分析结果表明，白鲢肝脏p38MAPK基因序列全长2418bp，开放阅读框1086bp，编码361个氨基酸；c-fos基因序列全长为1719bp，开放阅读框1059bp，编码352个氨基酸；c-juncDNA全长1931bp，开放阅读框927bp，编码308个氨基酸。生物信息学分析发现，白鲢p38MAPK蛋白相对分子质量为41.64kD,理论等电点为5.54，该蛋白是一个不稳定蛋白，具有较强的亲水性。c-Fos蛋白相对分子质量为38.242kD，理论等电点为4.93，该蛋白是一个不稳定蛋白且具有较强的亲水性。c-Jun蛋

6、白相对分子质量为33.928kD，理论等电点为9.08，是一个不稳定蛋白且具有一定的亲水性。二级结构预测显示，p38MAPK包含45.71%α-螺旋、13.02%的延伸链、4.99%的β-折叠和36.29%的无规则卷曲；c-Fos包含25.85%的α-螺旋、12.78%的延伸链、1.42%的β-折叠和59.94%的无规则卷曲；c-Jun包含32.14%的α-螺旋、5.52%的延伸链、1.62%的β-折叠和60.71%的无规则卷曲。对其功能结构位点分析发现，p38MAPK在35~309aa之间存在一个保守的丝氨酸/苏氨酸激酶区；c-Fos和c-Jun分别在108~172

7、aa和227~291aa处有一个典型的亮氨酸拉链结构。通过构建氨基酸系统发育树显示，白鲢p38MAPK与鲤鱼同源性高达96％，白鲢c-Fos与草鱼c-Fos同源性高达97%，白鲢c-Jun与草鱼c-Jun同源性高I达95%，与哺乳动物同源性相对较低。另外，qPCR检测结果显示p38MAPK、c-fos和c-jun在白鲢各个组织均有表达，其中p38MAPK表达量高低依次是肌肉＞肠＞脾＞肾＞鳃＞肝＞心＞脑；c-fos表达量高低依次是肝＞脾＞肾＞肠＞肌肉＞鳃＞脑＞心；c-jun表达量高低依次是肝＞肠＞心＞脑＞脾＞肾＞肌肉＞鳃。通过上下增减剂量法(upand