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时间:2020-03-08
《β-葡萄糖醛酸苷酶的N-糖基化设计及热稳定性研究.pdf》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、β-葡萄糖醛酸苷酶的N-糖基化设计及热稳定性研究樊艳爽2015年1月中图分类号:TQ028.1UDC分类号:540β-葡萄糖醛酸苷酶的N-糖基化设计及热稳定性研究作者姓名樊艳爽学院名称生命学院指导教师刘桂艳副教授李春教授答辩委员会主席郭淑元教授申请学位理学硕士学科专业生物学学位授予单位北京理工大学论文答辩日期2015年1月N-GlycosylationDesignandThermostabilityResearchofβ-glucuronidaseCandidateName:YanshuangFanSchoolorDepartment:Scho
2、olofLifeScienceAdvisor:AssociateProf.GuiyanLiuProf.ChunLiChair,ThesisCommittee:Prof.ShuyuanGuoDegreeApplied:MasterofScienceMajor:BiologyDegreeby:BeijingInstituteofTechnologyTheDateofDefence:January,2015研究成果声明本人郑重声明:所提交的学位论文是我本人在指导教师的指导下进行的研究工作获得的研究成果。尽我所知,文中除特别标注和致谢的地方外,学位论文
3、中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得北京理工大学或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的合作者对此研究工作所做的任何贡献均已在学位论文中作了明确的说明并表示了谢意。特此申明。签名:日期:北京理工大学硕士学位论文摘要N-糖基化修饰是真核生物最为常见的翻译后修饰之一,其对蛋白质的分泌、活性、功能和结构稳定性有重要影响。而课题组前期将来自PenicilliumpurpurogenumLi-3菌中的β-葡萄糖醛酸苷酶在毕赤酵母中重组表达后发现其发生了糖基化修饰,而经糖基化修饰后的β-葡萄糖醛酸苷酶(PGUS-P)的热
4、稳定性与野生型相比得到明显提高。因此,本论文针对N-糖基化修饰对PGUS-P稳定性的影响展开研究,在PGUS-P模拟结构基础上,设计了新的N-糖基化修饰位点,以期获得稳定性提高的β-葡萄糖醛酸苷酶。主要研究结果如下:首先以毕赤酵母重组表达β-葡萄糖醛酸苷酶(PGUS-P)为研究对象,采用半理性设计方法对其进行糖基改性,通过定点突变在PGUS-P中引入具有EAS(enhancedaromaticsequence)序列的新N-糖基化位点。通过活性筛选和糖蛋白筛选,最终得到三个成功引入新糖基化修饰的突变酶PGUS-P-26,PGUS-P-35和PGU
5、S-P-259。其次,对PGUS-P-26,PGUS-P-35和PGUS-P-259的酶学性质和催化特性进行了分析,结果表明:三个突变酶的最适温度均由50℃提高到55℃,但最适pH未发生变化。稳定性分析结果表明:引入糖基化修饰后PGUS-P-35和PGUS-P-259的热稳定性均得到改善,在65℃下保温90min时,PGUS-P-35和PGUS-P-259的剩余酶活力分别维持在95%和93%,而PGUS-P在65℃下保温相同时间后剩余酶活为84%左右。糖基化修饰并未对三株突变酶的pH稳定性造成明显变化。反应动力学常数测定表明,PGUS-P-35
6、的最大反应速度由111.25μmol/Lmin-1提高为120.48μmol/Lmin-1,并且引入糖基化修饰后,PGUS-P-26,PGUS-P-35和PGUS-P-259催化甘草酸的Km变小,Kcat/Km增加,表明其对底物甘草酸的亲和力和催化效率均得到提高。最后对突变酶的结构稳定性进行分析,荧光光谱分析表明三个突变酶的荧光峰均发生红移,表明荧光发射基团(Try)的微环境极性增加,糖基化修饰后蛋白质三级结构发生变化,其中以PGUS-P-35的偏移最大。而对氨基酸变化前后结构的模拟比对分析结果表明,只有PGUS-P-26的氨基酸突变导致了酶蛋
7、白的空间结构发生了微弱的变化,而PGUS-P-35和PGUS-P-259的空间结构均未发生变化,因此,进一步说明了突变酶稳定性的改变是由于糖基化糖链的添加导致的。关键词:N-糖基化修饰;糖基改性;β-葡萄糖醛酸苷酶;毕赤酵母;稳定性I北京理工大学硕士学位论文AbstractN-linkedglycosylationisoneofthemostprevalentpost-translationalmodificationsineukaryaandoftenhasmarkedimpactonthesecretion,activity,functio
8、nandstructurestabilityofprotein.Inourpreviousresearch,aβ-glucuronidasefromP
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