花刺参粘多糖对血管平滑肌细胞粘附分子表达的影响.ppt

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1、花刺参粘多糖对血管平滑肌细胞粘附分子表达的影响研究目的观察花刺参粘多糖对TNF-α诱导的大鼠细胞间粘附分子（ICAM）-1、血管细胞粘附分子（VCAM）-1表达的影响。为临床开发有效的防治动脉粥样硬化、再狭窄药物提供理论基础。方法与步骤Wista大鼠选取5-12代细胞VSMC原代培养空白对照组花刺参粘多糖组TNF-α刺激组RT-PCR、流式细胞仪、细胞粘附实验检测处理后VSMC粘附分子的表达情况大鼠胸主动脉平滑肌细胞的原代培养与鉴定无菌条件下取4-6周龄Wista大鼠胸主动脉，分离血管中膜平滑肌层，组织贴块法原代培养，0.25%胰蛋白酶消化传代，实验选用生长稳定的5-12代细胞。SM-α-a

2、ctin免疫荧光法鉴定证实结果判定：阳性细胞呈黄绿色荧光。荧光显微镜下细胞数/同一视野光镜下细胞数×100%=阳性细胞率细胞分组及用药取生长良好的5-12代VSMC，用0.25%胰蛋白酶消化，以1×105/ml密度接种于培养瓶或培养板中，培养至80%融合时，换用含0.5%FBS培养液继续培养24h，使VSMC同步化，细胞随机分为5组，各组分别加入下列药物，使TNF-α的终浓度为10ng/ml空白组：2%FBSTNF-α刺激组：2%FBS+TNF-α花刺参粘多糖组：2%FBS+TNF-α+花刺参粘多糖1.5mg/ml、3mg/ml、6mg/ml组RT-PCR检测各组细胞粘附分子mRNA表达情况

3、细胞总RNA提取：采用异硫氰酸胍一步法提取细胞总RNA。RTPCRPCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳。凝胶成相系统分析仪观察并摄片。结果分析:待测mRNA的表达量以待测粘附分子与内参照ß-actin积分光密度值的比值表示流式细胞仪检测将上述分组与用药细胞用0.25%的胰蛋白酶消化，PBS收集细胞，FITC-ICAM-1、PE-VCAM-1一抗重悬细胞，冰上避光孵育30min，PBS洗两次，离心弃上清0.7mlPBS重悬细胞，流式细胞仪检测其平均荧光强度。单核细胞-平滑肌细胞粘附试验接种于96孔板生长状态良好的VSMC按上述分组及用药制备单核细胞悬液单核细胞与VSMC粘附30min染色、脱色后于酶

4、标仪570nm读取各孔A值统计分析所有实验数据采用SPSS10.0软件做统计学处理，数据以均数±标准差表示。计量资料两组间的比较用t检验，各组间差异用单因素方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。实验结果大鼠血管平滑肌细胞的原代培样及鉴定×100×200组织贴块法原代培养峰-谷样生长SM-α-actin免疫荧光鉴定阳性×100阴性对照×400阳性×400RT-PCR检测ST对大鼠血管平滑肌细胞粘附分子mRNA表达的影响ICAM-1（185bp）ß-actin（417bp）*****与TNF-α刺激组比较*P<0.05**P<0.01RT-PCR检测ST对大鼠血管平滑肌细胞粘附分子mRNA

5、表达的影响ß-actin（417bp）VCAM-1（561bp）******与TNF-α刺激组比较*P<0.05**P<0.01流式细胞仪检测ST对大鼠血管平滑肌细胞ICAM-1表达的影响同型对照空白对照组TNF-α刺激组ST小剂量组ST中剂量组ST大剂量组流式细胞仪检测ST对大鼠血管平滑肌细胞VCAM-1表达的影响同型对照空白对照组TNF-α刺激组ST小剂量组ST中剂量组ST大剂量组与TNF-α刺激组比较*P<0.05**P<0.01************单核细胞-平滑肌细胞粘附试验A、空白对照组B、TNF-α刺激组C、ST小剂量组D、ST中剂量组E、ST大剂量组ABCED单核细胞-平滑

6、肌细胞粘附试验*****与TNF-α刺激组比较*P<0.05**P<0.01结论大鼠胸主动脉VSMC正常情况下粘附分子ICAM-1、VCAM-1表达量很低TNF-α可明显刺激VSMC表达ICAM-1、VCAM-1两种粘附分子ST可显著抑制TNF-α刺激的VSMC粘附分子ICAM-1、VCAM-1的表达，可阻止VSMC与单核细胞的粘附，且具有剂量依赖性ST抑制促炎症因子刺激导致的细胞粘附分子表达上调，可能具有增加粥样斑块稳定性和延缓动脉粥样硬化进程的作用，对减轻血管壁的炎症反应有一定作用，具有临床开发前景。二花刺参粘多糖对血管平滑肌细胞增殖及凋亡的影响本项研究的目的明确花刺参粘多糖（ST）及复

7、方ST对体外培养的大鼠血管平滑肌细胞(vasculesmoothmusclecell,VSMC）增殖的影响明确ST及复方ST对体外培养的大鼠VSMC凋亡的影响从细胞、分子水平探讨ST及复方ST制剂防治PTCA后再狭窄的作用机制。实验方法Wistar大鼠取胸主动脉中层平滑肌细胞作原代培养（组织块法）传代5-12次，10%FBS静止培养24h，0.5%FBS同步化细胞24hST组他汀组复方组模型组对照组MTT、流