免疫印迹实验步骤及问题解决.docx

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1、免疫印迹实验步骤及问题解决一、实验步骤试剂和缓冲液1xRIPA缓冲液:50mMTris，150mMNaCl，0.1%SDS，0.5%SDS，1%TritonX-100或NP40.1xPBS缓冲液:137mMNaCl，2.7mMKCl，2.7mMNa2HPO4，2.7mMKH2PO4，pH7.4BCA或Bradford蛋白分析试剂盒1.5MTris缓冲液（pH8.8）:90.68gTris-HCltoddH2O，500ml溶液pH调节到8.81.0MTris缓冲液（pH6.8）:60.58gTris-HCltoddH2O，500ml溶液pH调节到6.810

2、%APS:100mgAP溶于1mlddH2O。用前准备10%SDS:10gSDS溶于100mlddH2O。1xTris-甘氨酸电泳缓冲液:25mMTris，230mM甘氨酸（pH8.3），0.1%SDS。3xSDS蛋白加样缓冲液:150mMTris（pH6.8），6%SDS，30%甘油，30mMEDTA和0.2%溴酚蓝1xTTBS:25mMTris（pH7.5）:0.15MNaCl，0.05%Tween-20，0.001%硫柳汞1x转移缓冲液:3gTris，14.4g甘氨酸和200ml甲醇，加ddH2O到1L样品准备细胞培养样品贴壁细胞去除培养基，用1X

3、PBS冲洗去掉残留培养基加入预冷的400ul-1ml1XRIPA缓冲液/100mm平皿。在冰上孵育5-10min。完全刮下细胞并转移到在冰上预冷的1.5ml离心管中。（可选）充分混匀或超声处理。4°C下12,000rpm离心10-15min并收集上清总蛋白用前需储存在-20°C。悬浮细胞（可选）取出100ul细胞培养也进行细胞计数。将细胞转移到预冷的1.5ml或15ml离心管2000rpm4°C离心5min。去除培养基并用1ml预冷的1xPBS重悬细胞，然后转移到1.5ml离心管中。2000rpm4°C离心5min。用1ml预冷的RIPA缓冲液/107细

4、胞重悬细胞细胞悬液在冰上孵育并摇床30min，或充分混匀或超声处理。4°C12000rpm离心10-15min收集上清备用。总蛋白需要在用前储存在-20°C。组织组织准备和定量。将组织切成小块。加入500-600ul预冷的1xRIPA缓冲液/100mg组织。将组织充分混匀4°C12000rpm离心15-20min。收集上清。总蛋白在用前应储存在-20°C。蛋白定量Bradford分析和BCA分析请查看来邦的综述蛋白定量。SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶6%-15%分离胶上注入5%的浓缩胶并插上梳子（10或者15孔）。分离胶浓度（%）蛋白大小范围（kDa）8

5、25-2001015-10012.510-701512-45204-40表1：蛋白分离范围由分离胶浓度决定。上样和电泳2XSDS蛋白上样缓冲液与蛋白样品1:1充分混匀。注胶前先将样品在50-60°C预热。预染Marker可用于监控蛋白分离和转移效率。在1XTris-甘氨酸缓冲液在60-120V跑电泳1-3小时分离胶（10ml）浓缩胶（3ml）6%8%10%12%15%6%H205.34.64.03.32.32.130%丙烯酰胺混合物*2.02.73.34.05.00.51.5MTris（pH8.8）2.52.52.52.52.51.0MTris（pH6.

6、8）0.3810%SDS0.10.10.10.10.10.0310%APS0.10.10.1.10.10.03TEMED0.0080.0060.0040.0040.0040.003表2：分离胶（10ml）和浓缩胶（3ml）的制备方案蛋白转移将蛋白转移到PVDF或NC*膜上进行抗体检测1.将电泳材料，如胶、whatman纸和海绵放入1X转移缓冲液中预先浸润.2.PVDF膜应在甲醇中预先孵育10秒到1分钟，然后移入转移缓冲液中3.将材料按如下顺序放置:板（黑色面），海绵，Whatman纸，胶，膜，Whatman纸，海绵，板（亮面）.4.将转移装置安置好，黑色

7、面对应黑色电极。5.转移到冷的1X转移缓冲液中.电转电流和时间应该根据电泳装置的厂家说明推荐设置。*NC膜不能用甲醇孵育。将膜放入溶有5%脱脂奶粉的1xTBST中25°C孵育1小时（或在摇床上4°C孵育过夜）。抗体孵育1.按照推荐浓度或根据结果优化浓度，将一抗溶于1XTBST+3%BSA中。2.在4°C孵育过夜或更长时间，或者在室温下4小时。3.回收一抗，保存在4°C。然后在室温下在摇床上冲洗膜三次，每次5-10min。4.将二抗放入1XTBST中稀释，然后室温下孵育膜1小时，或4°C摇床上2-4小时。5.在室温摇床上用TBST洗三次，每次10minEC

8、L+系统和X-ray胶卷被用于HRP标记的二抗。二、问题解决没有信号，可能原因检