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1、免疫印迹免疫印迹 免疫印迹（immunoblotting）又称蛋白质印迹（Westernblotting），是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。由于免疫印迹具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术。免疫印迹常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。结合化学发光检测，可以同时比较多个样品同种蛋白的表达量差异。免疫印迹法的基本原理 将混合抗原样品在凝胶板上进行单向或双向电泳分离,然后取固定化基质膜与凝胶相贴。在印迹纸的自然吸附力、电场力或
2、其它外力作用下,使凝胶中的单一抗原组份转移到印迹纸上,并且固相化。最后应用免疫覆盖液技术如免疫同位素探针或免疫酶探针等,对抗原固定化基质膜进行检测和分析。免疫印迹法的基本步骤 免疫印迹法（以抗原分析为例）基本上可分为抗原分离、抗原印迹和抗原检定三个步骤。在每一步中因采用的具体实验方法不同,可构成多种免疫印迹分析系统。免疫印迹法的优点 免疫印迹法是一项分析抗原、抗体的技术。它具有下列优点： 1、湿的固定化基质膜柔韧,易于操作； 2、固定化的生物大分子可均一的与各种免疫探针接近,不会象凝胶那样受孔径阻隔； 3、免疫印迹分析只需少量试剂； 4、孵育、洗涤的时间明显减短； 5、可同时制作
3、多个拷贝,用于多种分析和鉴定； 6、结果以图谱形式可长期保存； 7、免疫探针可通过降低PH值等方法,象抹去录音磁带一样将探针抹掉,再换用第二探针进行分析检测。免疫印迹法的应用范围及优点不仅局限于此,它必将随着这一方法的深入研究而不断发展和完善。免 疫 印 迹免疫印迹又常称Westernblot，是一综合性的免疫学检测技术。它利用SDS-PAGE技术将生物样品中的蛋白质分子按分子量的大小在凝胶上分离开，然后用电转移的方法将蛋白转移到固相膜上（NC、尼龙或PVDF膜），最后进行免疫学检测。由于免疫学检测敏感性高，并且通过SDS-PAGE样品中的待检蛋白得到了浓缩，因此，Westernblot的
4、灵敏度特别高，可达到放射免疫的分析水平。而使用一般的免疫学检测技术（如ELISA、放射免疫沉淀）检测时，由于要求被检测蛋白可溶、要求抗体效价高、亲和力高和特异性强，往往并不容易达到目的。而Westernblot却没有这些缺点。因此，Westernblot广泛应用于生物样品中是否存在某一蛋白质（抗原）的检测。也可用于粗略测定抗原蛋白的相对含量和抗原多肽链的相对分子量。一、原理是SDS-PAGE电泳与免疫检测相结合的一种蛋白质检测方法。强阴离子去污剂SDS与还原剂并用，通过加热使蛋白质解离，大量的SDS结合蛋白质，使其带相同密度的负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）时，不同蛋白质的迁移率仅取决
5、于分子量。然后将蛋白质转移到膜上，继而用抗体进行检测。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。二、实验材料 诱导与未诱导的带有口蹄疫病毒保护性抗原VP1与LTB融合蛋白基因的工程菌。三、仪器、耗材与试剂（一）仪器、耗材DYY－6C电泳仪、DYCZ－24D垂直板电泳槽、封口机、DYCP－40C半干式转移电泳槽、5ml、1ml
6、、200μl、50μl、10μl移液器及相应的Tip、50ml烧杯。新华滤纸、PVDF膜。剪刀、刀片，直尺、铅笔、一次性手套。（二）试剂1.30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲双丙烯酰胺（Bis）1.0g，混匀后加ddH2O，37OC溶解,定容至100ml,棕色瓶存于4OC。2.1.5MTris-HCl(pH8.8)：Tris18.17g加ddH2O溶解,浓盐酸调pH至8.8,定容至100ml。3.1MTris-HCl(pH6.8)：Tris12.11g加ddH2O溶解,浓盐酸调pH至6.8,定容至100ml。4.10%SDS：电泳级SDS10.0g加ddH2O68℃助溶,浓盐
7、酸调至pH7.2,定容至100ml。5.10´电泳缓冲液(pH8.3)：Tris3.02g，甘氨酸18.8g，10%SDS10ml加ddH2O溶解,定容至100ml。6.10%过硫酸铵（AP）：1gAP加ddH2O至10ml。7.14.4-97.4kDa低分子量蛋白质标准（Marker）8.2´SDS电泳上样缓冲液：1MTris-HCl(pH6.8)2.5ml，b-巯基乙醇1.0ml，SDS0.6
