蛋白质免疫印迹实验.pdf

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1、蛋白质免疫印迹实验（WesternBlot）蛋白质免疫印迹（WesternBlot）实验原理蛋白质免疫印迹（WesternBlot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的一种蛋白质检测方法。对已知的表达蛋白，可以用相应的抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可以融合部分的已知片段进行检测，如HA-tag，Flag-tag，c-myc-tag等。WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺（PAGE）凝胶电泳，被检测的是蛋白质，其中检测探针是相应的抗体，显色是使用的标记后的二抗。经过PAGE

2、凝胶分离的蛋白质样品，转移到固相载体上，如醋酸纤维素膜，固相载体以非共价键的形式吸附蛋白质。然后以固相载体上的蛋白质作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，然后再与标记后的二抗起反应，经过底物显色以检测目的蛋白。蛋白质免疫印迹（WesternBlot）原理蛋白免疫印迹法主要分为三个阶段进行第一阶段是SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)在这个阶段，经过变性处理的蛋白质样品经SDS处理后会带上阴性电荷,在聚丙烯酰胺-1-凝胶中在电场的作用下从阴极向阳极泳动,且分子量越小,泳动速度就越快。所以在此

3、阶段，根据蛋白的泳动速度可以将样品中的蛋白质根据其分子量的大小进行分离，此阶段分离效果肉眼不可见。如果想观察蛋白的电泳情况，可以在电泳完成后进行考马斯亮蓝染色进行观察；第二阶段为电转移，又称为转膜。即将在凝胶中已经分离的蛋白质条带通过电场的作用转移至硝酸纤维素膜上,一般选用恒流300mA，通电90min即可将凝胶中的蛋白条带转移到醋酸纤维素膜载体上。转移到载体上的蛋白条带也是肉眼不可见的，如果想观察转移的效果，可以在转移后对载体进行丽春红染液染色。第三阶段为酶联免疫显色检测将印有蛋白质条带的硝酸

4、纤维素膜(相当于包被了抗原的固相载体)依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后,加入能形成不溶性显色物的酶反应底物,使目的条带蛋白显色。在该阶段中，常用的HRP显色底物为3,3'-二氨基联苯胺(呈棕色)和4-氯-1-萘酚(呈蓝紫色).阳性反应的条带清晰可辨,并可根据SDS-PAGE时加入的分子量标准,确定各组分的分子量。WesternBlot实验流程二、蛋白免疫印迹实验材料1、丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v

5、)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液：丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml，储于棕色瓶，4℃避光保存。严格保证PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可以过滤。2、十二烷基硫酸钠SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS，1mlH2O去离子水配制，室温保存。-2-3、分离胶缓冲液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合，加水稀释到100

6、ml终体积。4、浓缩胶缓冲液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于40mlH2O中，用约48ml1mol/LHCL调至pH6.8加水稀释到100ml终体积。过滤后室温保存。这两种缓冲液必须使用Tris碱制备，再用HCl调节PH值，而不用Tris.CL。5、TEMED原溶液N，N，N’N’四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。PH太低时，聚合反应受到抑制。10%(w/v)过硫酸胺溶液。提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。去离子水配制数ml，

7、临用前配制.6、SDS-PAGE加样缓冲液:pH6.80.5mol/LTris缓冲液8ml，甘油6.4ml，10%SDS12.8ml，巯基乙醇3.2ml，0.05%溴酚蓝1.6ml，H2O32ml混匀备用。按1:1或1:2比例与蛋白质样品混合，在沸水终煮10min混匀后再上样，一般为20-25μl，总蛋白量100μg。7、Tris-甘氨酸电泳缓冲液:30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸馏水溶解至1000ml，得0.25mol/LTris-1.92mol/L甘氨酸电极缓冲液。临用

8、前稀释10倍。8、转膜缓冲液：配制1L转移缓冲液，需称取2.9g甘氨酸、5.8gTris碱，并加入200ml甲醇，加水至总量1L。9、丽春红染液储存液：丽春红S2g三氯乙酸30g磺基水杨酸30g加水至100ml用时上述储存液稀释10倍即成丽春红S使用液。使用后应予以废弃。10、脱脂牛奶5%(w/v)。11、Tris缓冲盐溶液(TBS):20mmol/LTris/HCL(pH7.5)，500mmol/LNaCl。13、Tween-20。三、蛋白样品的制备可以使用适当的裂解液，裂解细胞获得。对于某些