细胞培养操作规范ppt课件.ppt

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1、细胞培养操作规范1一：细胞培养的基本条件：1.无菌环境：细胞培养间消毒a：使用前紫外照射20-30分钟b：使用完75%酒精擦拭台面，紫外照射15分钟。c：每两周用84消毒液擦拭地面、台面一次的方式进行消毒2超净工作台：使用前开启柜内紫外灯照射15－30分钟使用时开启鼓风，在台面内操作使用完毕后要用75%酒精将台面和台内四周擦拭干净，紫外照射10分钟。3CO2培养箱：1.设定的条件为37℃，5％CO2。2.使用CO2培养箱应注意的问题：▫用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。▫保持培养箱内空气干净，定期消毒擦拭。▫箱内蒸馏水槽中定期更换灭菌蒸馏

2、水3000毫升，以保持箱内湿度。4控制水盘内污染的方法：1、 定期(至少每两周一次)，更换水盘内的无菌蒸馏水或无菌去离子水。2、 在水盘内添加适量硫酸铜，预防真菌污染。配制方法：20g无水硫酸铜＋5ml浓硫酸＋1L灭菌纯水。3、 水盘内添加适量抗生素。4、定期为培养箱（含水盘）进行一次高温灭菌。52.细胞培养条件细胞培养器皿：细胞培养瓶：▫25平方厘米（加液量3-5ml）▫75平方厘米（加液量10-15ml）▫150平方厘米（加液量40ml）细胞培养板：6细胞培养皿▫35mm（加液量3ml)▫60mm（加液量5ml)▫100mm（加液量10ml)150

3、mm(加液量15ml)7常用培养基：RPMI1640：适合许多种细胞，如肿瘤细胞、正常细胞的原代培养、传代培养等。尤其适合人白细胞，如H9、HL-60、IM-9和K-562等细胞系的培养。DMEM：DMEM（A）【不含谷氨酰胺、可高压灭菌】DMEM（H）【含谷氨酰胺、高糖型（4500mg/L）、除菌过滤灭菌】DMEM（L）【含谷氨酰胺、低糖型(1000mg/L)、除菌过滤灭菌】8血清：常用血清种类：胎牛血清、新生牛血清、小牛血清血清的灭活（消除补体活性）56℃，30分钟。使用浓度：5%-20%，一般10%血清的消毒：过滤除菌血清解冻步骤：–20℃或–7

4、0℃至4℃冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装，一般用15ml无菌离心管分装。9谷氨酰胺：谷氨酰胺在溶液中很不稳定，4℃放置1周可分解50％，故应单独配制，置于-20℃保存，临用前加入培养液。10消化液：胰蛋白酶溶液：常用浓度：0.25%。消化时间：2-10分钟（显微镜下观察）用含血清培养液终止其对细胞的消化作用。11EDTA溶液使用浓度：▫0.02%，与胰蛋白酶配合使用。•EDTA不能被血清中和，终止消化后，需用培养液或PBS彻底冲洗培养瓶。12二：细胞培养前准备工作：1.相关耗材：细胞培养皿（瓶）若干、离心管（15ml,50ml）、100ml玻璃瓶4

5、个、500ml玻璃瓶4个、2mL冻存管、tip头及枪头盒、吸管（10ml刻度）、吹打管、50ml、10ml、5ml注射器、一次性针孔过滤器（0.22um）、一次性口罩、帽子、手套、纱布、牛皮纸、标签纸132.相关试剂及配制方法：细胞培养的相关试剂配制均在超净工作台上操作，严格按照无菌操作流程！完全培养基:基础培养基90%血清10％碳酸氢钠2.0g/L青、链霉素100U／ml过滤除菌4℃保存使用时加入谷氨酰胺（配制方法：谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液，充分搅拌溶解后，过滤除菌，分装小瓶，-20℃保存，使用时可向

6、100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液。14胰蛋白酶-EDTA消化液称取0.25g的胰蛋白酶和0.02g的EDTA用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液或D-Hank’s配制，用滤器过滤除菌，-20℃分装保存。细胞冻存液配制：90%血清和10%DMSO153：常用培养器皿的清洗及消毒玻璃器皿的清洗刷洗（自来水）、浸泡（洗衣粉）、冲洗（自来水），烘干（50℃，恒温干燥箱）酸泡（24小时，至少6小时）、清洗（流水冲洗和蒸溜水冲洗15遍以上），50℃烘干。新的橡胶制品洗涤方法0.5MNaOH煮沸15分钟或浸泡过夜，流水冲洗，0.5MHCl煮沸15分钟或浸泡过

7、夜，流水冲洗，蒸馏水冲洗15次以上，50℃烤干备用。16消毒：消毒前常用的包装：牛皮纸、棉布、铝饭盒包装高压蒸汽消毒：121℃，维持20-30分钟。17三：细胞培养方法1.细胞复苏方法：从液氮中取出冷冻管，迅速投入37℃水浴中，甩动冻存管，使其融化（1分钟左右）；5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上；1000转低速离心5分钟；去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。182.细胞换液方法：换液指针：观察培养基颜色：当培养基的颜色由红色渐渐褪成橙黄色，颜色清亮，无杂质，无浑浊观察细胞生长状态：细胞生长状态良好，确认无细菌真菌污染换液方法：将吸管、废液缸放

8、入工作台开启细胞培养房及工作台紫外消毒20分钟，开启恒温水浴箱，培养液预热关闭紫外灯，开启工作