细胞培养操作规范ppt课件.ppt

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1、细胞培养操作规范1一:细胞培养的基本条件:1.无菌环境:细胞培养间消毒a:使用前紫外照射20-30分钟b:使用完75%酒精擦拭台面,紫外照射15分钟。c:每两周用84消毒液擦拭地面、台面一次的方式进行消毒2超净工作台:使用前开启柜内紫外灯照射15-30分钟使用时开启鼓风,在台面内操作使用完毕后要用75%酒精将台面和台内四周擦拭干净,紫外照射10分钟。3CO2培养箱:1.设定的条件为37℃,5%CO2。2.使用CO2培养箱应注意的问题:▫用螺旋口瓶培养细胞时,需将瓶盖微松,以保证通气。▫保持培养箱内空气干净,定期消毒擦拭。▫箱内蒸馏水槽中定期更换灭菌蒸馏

2、水3000毫升,以保持箱内湿度。4控制水盘内污染的方法:1、 定期(至少每两周一次),更换水盘内的无菌蒸馏水或无菌去离子水。2、 在水盘内添加适量硫酸铜,预防真菌污染。配制方法:20g无水硫酸铜+5ml浓硫酸+1L灭菌纯水。3、 水盘内添加适量抗生素。4、定期为培养箱(含水盘)进行一次高温灭菌。52.细胞培养条件细胞培养器皿:细胞培养瓶:▫25平方厘米(加液量3-5ml)▫75平方厘米(加液量10-15ml)▫150平方厘米(加液量40ml)细胞培养板:6细胞培养皿▫35mm(加液量3ml)▫60mm(加液量5ml)▫100mm(加液量10ml)150

3、mm(加液量15ml)7常用培养基:RPMI1640:适合许多种细胞,如肿瘤细胞、正常细胞的原代培养、传代培养等。尤其适合人白细胞,如H9、HL-60、IM-9和K-562等细胞系的培养。DMEM:DMEM(A)【不含谷氨酰胺、可高压灭菌】DMEM(H)【含谷氨酰胺、高糖型(4500mg/L)、除菌过滤灭菌】DMEM(L)【含谷氨酰胺、低糖型(1000mg/L)、除菌过滤灭菌】8血清:常用血清种类:胎牛血清、新生牛血清、小牛血清血清的灭活(消除补体活性)56℃,30分钟。使用浓度:5%-20%,一般10%血清的消毒:过滤除菌血清解冻步骤:–20℃或–7

4、0℃至4℃冰箱溶解一天,至室温下全溶后再分装,一般用15ml无菌离心管分装。9谷氨酰胺:谷氨酰胺在溶液中很不稳定,4℃放置1周可分解50%,故应单独配制,置于-20℃保存,临用前加入培养液。10消化液:胰蛋白酶溶液:常用浓度:0.25%。消化时间:2-10分钟(显微镜下观察)用含血清培养液终止其对细胞的消化作用。11EDTA溶液使用浓度:▫0.02%,与胰蛋白酶配合使用。•EDTA不能被血清中和,终止消化后,需用培养液或PBS彻底冲洗培养瓶。12二:细胞培养前准备工作:1.相关耗材:细胞培养皿(瓶)若干、离心管(15ml,50ml)、100ml玻璃瓶4

5、个、500ml玻璃瓶4个、2mL冻存管、tip头及枪头盒、吸管(10ml刻度)、吹打管、50ml、10ml、5ml注射器、一次性针孔过滤器(0.22um)、一次性口罩、帽子、手套、纱布、牛皮纸、标签纸132.相关试剂及配制方法:细胞培养的相关试剂配制均在超净工作台上操作,严格按照无菌操作流程!完全培养基:基础培养基90%血清10%碳酸氢钠2.0g/L青、链霉素100U/ml过滤除菌4℃保存使用时加入谷氨酰胺(配制方法:谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液,充分搅拌溶解后,过滤除菌,分装小瓶,-20℃保存,使用时可向

6、100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液。14胰蛋白酶-EDTA消化液称取0.25g的胰蛋白酶和0.02g的EDTA用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液或D-Hank’s配制,用滤器过滤除菌,-20℃分装保存。细胞冻存液配制:90%血清和10%DMSO153:常用培养器皿的清洗及消毒玻璃器皿的清洗刷洗(自来水)、浸泡(洗衣粉)、冲洗(自来水),烘干(50℃,恒温干燥箱)酸泡(24小时,至少6小时)、清洗(流水冲洗和蒸溜水冲洗15遍以上),50℃烘干。新的橡胶制品洗涤方法0.5MNaOH煮沸15分钟或浸泡过夜,流水冲洗,0.5MHCl煮沸15分钟或浸泡过

7、夜,流水冲洗,蒸馏水冲洗15次以上,50℃烤干备用。16消毒:消毒前常用的包装:牛皮纸、棉布、铝饭盒包装高压蒸汽消毒:121℃,维持20-30分钟。17三:细胞培养方法1.细胞复苏方法:从液氮中取出冷冻管,迅速投入37℃水浴中,甩动冻存管,使其融化(1分钟左右);5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上;1000转低速离心5分钟;去上清,加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。182.细胞换液方法:换液指针:观察培养基颜色:当培养基的颜色由红色渐渐褪成橙黄色,颜色清亮,无杂质,无浑浊观察细胞生长状态:细胞生长状态良好,确认无细菌真菌污染换液方法:将吸管、废液缸放

8、入工作台开启细胞培养房及工作台紫外消毒20分钟,开启恒温水浴箱,培养液预热关闭紫外灯,开启工作

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