细胞培养—无菌操作.ppt

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1、细胞培养之无菌操作目录实验器具和材料的准备培养室的消毒洗手和着装无菌操作污染及防治无菌定义：对一个环境所谓的无菌，是指在环境中一切有生命活动的微生物的营养细胞及其芽胞或孢子都不存在无菌技术定义：无菌技术是细胞工程的基本技术包括实验器具和材料的准备、培养室和超净台的消毒、洗手和着装、无菌操作等意义：因体外培养细胞没有抗感染能力，防止污染则是决定培养成功与否的首要条件，即便是在设备完善的实验室，若实验者粗心大意，技术操作不规范，也会导致污染。为在一切操作中尽可能保证无菌，每一项工作我们都必须做到有条不紊和完全可靠。消毒灭菌消毒：是指杀死病原微生物、但不一定能杀死细菌

2、芽孢的方法。通常用化学的方法来达到消毒的作用。用于消毒的化学药物叫做消毒剂。灭菌：杀灭或除去特定环境或物品中一切微生物的过程。目前标准规定，灭菌过程必须使灭菌物品污染的微生物存活率减少到10-6及以下。消毒剂种类依据化学成分主要分为9种醛类消毒剂杂环类消毒剂含氯消毒剂过氧化物类消毒剂含碘消毒剂季铵盐类消毒剂酚类消毒剂胍类消毒剂醇类消毒剂重金属类消毒剂生物类消毒剂消毒新洁尔灭消毒液原理：新洁尔灭灭菌原理为破坏细胞膜、改变其渗透性而起杀菌作用84消毒液84消毒液是一种以次氯酸钠为主的高效消毒剂，主要成分是次氯酸钠，次氯酸钠的漂白性是其与水反应生成的次氯酸所带来的，因

3、次氯酸具有极强的氧化性，能够将大多数物质氧化，使其变性，因而能起到消毒作用消毒75%酒精消毒原理酒精之所以能消毒是因为酒精能够吸收细菌蛋白的水分，使其脱水变性凝固，从而达到杀灭细菌的目的。如果使用高浓度酒精，对细菌蛋白脱水过于迅速，使细菌表面蛋白质首先变性凝固，形成了一层坚固的包膜，酒精反而不能很好地渗入细菌内部，以致影响其杀菌能力。75%的酒精与细菌的渗透压相近，可以在细菌表面蛋白未变性前逐渐不断地向菌体内部渗入，使细菌所有蛋白脱水、变性凝固，最终杀死细菌，酒精浓度低于75%时，由于渗透性降低，也会影响杀菌能力。洁净级别—无菌药品生产所需的洁净区可分为4个级别

4、A级：高风险操作区，如灌装区、放置胶塞桶和与无菌制剂直接接触的敞口包装容器的区域及无菌装配或连接操作的区域，应当用单向流操作台（罩）维持该区的环境状态。单向流系统在其工作区域必须均匀送风，风速为0.36-0.54m/s（指导值）。应当有数据证明单向流的状态并经过验证。在密闭的隔离操作器或手套箱内，可使用较低的风速。B级：指无菌配制和灌装等高风险操作A级洁净区所处的背景区域。C级和D级：指无菌药品生产过程中重要程度较低操作步骤的洁净区。实验器具和材料的准备在开始实验前要制定好实验计划和操作计划，有关数据的计算要事先做好。根据实验要求，准备各种所需耗材物品及试剂，清

5、点无误后将其放置在操作场所进行消毒处理。凡是需要带入安全柜（超净台）的培养基、胰酶、培养皿（培养瓶）等耗材和试剂在经过消毒处理之后再用75%的酒精棉球擦拭表面。培养室的消毒进入无菌实验室前先穿好无菌服、戴帽子及口罩无菌实验室每周用0.2%的新洁尔灭拖洗地面、粘尘杆去除灰尘，再用臭氧消毒室内台面要保持洁净，做完实验后用75％酒精或千分之三新洁尔灭棉球擦拭超净工作台的台内、边台的台面、倒置显微镜的载物台等实验所用物品尽可能一次性准备好，避免多次出入洗手和着装实验人员进入净化车间流程：非净化区域→换拖鞋→进入更衣室→放个人物品→洗手烘干→戴上帽子→消毒双手→进入更衣室

6、→穿净化服→穿净化鞋→戴口罩→戴手套洗手和着装洗手和着装洗手和着装无菌操作—个人防护在实验室工作时必须使用个体防护装备个人衣服和普通实验服不能穿入细胞培养室内实验室内不能穿长摆裙，短裙及短裤，不得在实验室内穿露脚趾的鞋子实验室内严禁处理和配戴眼镜严禁穿着细胞培养室专用防护服离开实验室发生手套破损应立即更换无菌操作—超净台的消毒超净工作台台面每次实验前要用75%酒精擦洗，然后用紫外线消毒30min在工作台面消毒时切勿将培养细胞和培养用液同时照射紫外线消毒时工作台面上用品不可过多堆放，否则会遮挡射线降低消毒效果一些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用75%酒

7、精擦洗后置于台内同时紫外线消毒超净工作台超净台是做一般对人体没有直接伤害的常规细菌的操作实验，正压送风，工作台工作区域的气流形成为水平层流型。区内空气经初效过滤器过滤后，由风机压入静压箱，再经高效过滤器过滤，由此送出的洁净气流，以一定的均匀断面风速通过操作区将尘埃颗粒带走，从而形成高洁净的工作环境。超净空气的流速为２４～３０ｍ／ｍｉｎ，这已足够防止附近空气可能袭扰而引起的污染，这样的流速也不会妨碍采用酒精灯或本生灯对器械等的灼烧消毒生物安全柜生物安全柜一般是做致病菌，霉菌，酵母菌，病毒来用，操作区域是负压，简单说是往上处抽风的，当然致病菌也不是直接抽出排到室外，

8、是过滤在生物安全柜的顶部