细胞培养无菌操作技术

《细胞培养无菌操作技术》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、第三章基本培养技术第一节无菌操作的基本技术防止污染是决定培养成功或失败的首要条件。由于体外培养细胞缺乏抗感染能力，故在一切操作中要努力做到最大限度的无菌。细胞培养无菌操作基本技术分三个部分：工作环境及表面的处理，细胞培养所用玻璃及塑料制品的处理及培养液与培养细胞的处理。一、工作环境的处理(一)培养前准备为了做好培养前准备工作，宜制定出分门别类的操作卡片，如“分装血清”、“组织块贴壁初代培养”、“传代培养”、等等。各卡片上记有需用器材和物品名称、要求及数量等，实验者可按卡片收集所用物品，清点无误后，把用品放置于操作场地，然后进行消毒，可避免操作开始后，因物品不全在往返拿取时增加污染机会。1

2、．操作野消毒：现多用紫外线灯灭菌，效果很好。用30瓦紫外线管灯，操作箱消毒20一30分钟即可；操作室空间大，需消毒30～50分钟。净化工作台亦可设紫外线灯，主要用于消毒台面上用品，但对台面流动的空气无意义。在用紫外线灯照射期间，在操作台面上勿置培养细胞和培养用液等物，以免受射线影响(必要时可用纸张覆盖)。紫外线只有直接杀菌作用，工作野用品过多或重叠放置，物品相互遮挡射线，会降低消毒效果。2．洗手和着装：原则上和外科手术相同。在利用无菌箱工作时，因整个前臂要伸入箱内，洗刷时一定要清洗到肘部。可用软塑料瓶内盛75％酒精，瓶口插一弯管，右手捏出三五毫升入左手内，进行擦洗消毒极为简便；必要时亦可用

3、0.2％的新洁尔灭洗涤消毒。进行培养工作时，如利用净化台，仅戴口罩和工作帽，着一般工作服即可。在无菌室内工作需着消毒衣帽。3．火焰消毒：在无菌环境进行无菌操作时首先要点燃酒精灯,以后操作如安装吸管帽、启开或封闭瓶口等，都需经过火焰烧灼进行。已吸取过营养液的吸管不能再用火焰烧灼，因吸管头中残留营养液能烧焦形成炭膜，再用时会把有害物带入培养液中。消毒火焰要求无色或微蓝色，而红黄色或发黑的火苗，表示燃烧不完全或含有杂质，有害物能混入培养液内。因此酒精灯需用96％的不含杂质的酒精，绝不能含有二甲苯和甲醇。(二)培养操作进行培养操作时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。不能用

4、手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒触及部，如不便消毒时，应取备品更换。为便于拿送用品，工作台面上的用品要有合理的布局.原则上应是右手使用的东西放置在右侧，左手用品在左侧，酒精灯置于中央。工作由始至终要保持一定顺序性，组织或细胞在末做处理之前，勿过早暴露在空气中。培养液在末用前，不要过早开瓶；用后如不再重复使用，应立即封口。培养用瓶开瓶以后，应保持45度斜位或平放，开口向上长时间直立可增加落菌机会。吸取各种用液时均应分别使用吸管，不能混用，以防扩大污染或导致细胞交叉污染。工作中不能面向操作野讲话或咳嗽，以免唾沫把细菌或支原体带入工作台面发生污染。(三)实验结束后，将实验物品带出工作

5、台。如需要继续进行下一个实验，则用70%酒精擦拭无菌操作台面，再让无菌操作台风机运转10分钟后，才可进行下一个实验操作。无菌操作工作区域应保持清洁与宽敞，必要物品，如试管架、移液器或吸管头等可以暂时放置，其它实验用品用完后应及时移出，以利气体流通。（一）清洗在组织细胞培养中，体外细胞对任何有害物质都非常敏感,均能影响培养细胞的生长微生物产品附带杂物上次细胞残留物非营养成分的化学物质需要清洗的培养用品玻璃器皿的清洗胶塞的清洗塑料制品的清洗二、细胞培养所用器皿的清洗与消毒1、玻璃器皿的清洗包括浸泡、刷洗、浸酸和冲洗四个步骤清洗后的玻璃器皿干净透明无油迹不能残留任何物质浸泡：初次使用和培养使用后

6、的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附着物软化或被溶掉新的初次使用的玻璃器皿，在生产及运输过程中，玻璃表面带有大量的干固的灰尘，且玻璃表面常呈碱性及带有一些对细胞有害的物质等先用自来水简单刷洗，然后用5％稀盐酸液浸泡过夜，中和其中的碱性物质再次使用的玻璃器皿则常附有大量刚使用过的蛋白质，干固后不易洗掉用后立即浸入水中，要求完全浸入，不能留有气泡或浮在液面上刷洗：用毛刷沾洗涤剂刷洗，以除去器皿表面附着较牢的杂质刷洗要适度，过度会损害器皿表面光泽度浸酸：玻璃器皿浸泡到清洁液中清洁液对玻璃器皿无腐蚀作用，而其强氧化作用可除掉刷洗不掉的微量杂质浸泡时器皿要充满清洁液，勿留气泡或器皿露出清洁液面浸泡时间

7、：一般为过夜，不应少于6小时清洁液常用三种：重铬酸钾（g）浓硫酸（ml）蒸馏水（ml）强清洁液63∶1000∶200次强清洗液120∶200∶1000弱清洁液100∶100∶1000配制时可使重铬酸钾溶于水中，然后慢慢加浓硫酸。并不停的用玻璃棒搅拌，使产生的热量挥发，配制溶液应选择塑料制品。配时切记，不能把水加于硫酸内（将因硫酸遇水瞬间产生大量的热量使水沸腾，体积膨胀而发生爆溅）。洗液对皮肤、衣物等均有腐蚀作用，故应妥善