干细胞培养的无菌技术.doc

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1、干细胞培养的无菌技术干细胞的培养条件是相当严格的，每个成功的研究员对细胞的照顾甚于自己的孩子。而众多的成功经验屮，无菌技术无疑是最重要的一条：一、做好准备工作。不要急于进行细胞培养，要先设定计划，即步骤、工具、试剂。特别是将细胞用于大规模生产时，尤其如此。经过干热灭菌的容器一般认为可以在一周内保持无菌状态，如果准备多了，用不完的就得重新灭菌，耗费能源、占用灭菌空间；干热灭菌需耍一天的时间，当器皿准备不足时，可能错过了最佳操作时间，也许需要很久才能将细胞状态再调整好。二、刷玻璃器皿的过程：初洗、泡酸（一天）、自来水冲洗（10遍）、纯化水冲洗（3遍）、注射用水冲洗（3遍）。残留的酸可能会

2、抑制细胞生长，甚至导致细胞死亡，痛失辛苦得来的细胞，一定不能大忌、o三、实验进行前，无菌室及无菌操作台（laminarflow）以及紫外灯照射30-60min灭菌，以75%医用酒精擦拭无菌操作台，并开启无菌操作台风扇运转lOmin后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共亨培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以75%医用酒精擦拭无菌操作台面。操作间隔应让无菌操作台运转lOmin以上，再进行下一个细胞株的操作。四、无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞。必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其他实验用品用完即应移出

3、，以利于气流通畅。实验用品以75%医用酒精擦拭后方可带入无菌操作台。实验操作应在台而之屮央无菌区域，勿在边缘非无菌区域操作。五、小心取用无菌的实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后,以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45。取用，尽量勿将瓶盖盖门朝上放置桌面。六、无菌操作台内定期更换紫外线灯管及HEPA过滤膜，预滤网（300h/预滤网，3000h/HEPA）。七、水槽可添加消毒剂，定期更换水槽内的水。八、认真按照操作规程进行实验，一般不会导致污染，很多情况下是由于所用的试剂或培养基有污染而使实验失败。九、粉末培养基配置好后（加了血

4、清），一般在4°C下存放尽量不要超过1个月，如在・20°C存放时间可长一些，但最好也不要超过3〜4个月，可能对于永生化细胞株来说要求不是太高，我们在过去几年里一直是作原代细胞培养的，细胞娇弱，经验表明放置时间不宜过长。十、关于实验用品的清洗与消毒：用过的玻璃器皿先在清水屮浸泡30,min以上，然后加少许清洗剂，以超生波洗涤30min左右（如无超声波洗涤器可用软毛轻轻刷洗干净），捞出晾干，再在酪酸洗液中浸泡6-18h（或过夜）后，自来水清洗10-15遍，双蒸水清洗3-4遍，晾干，高压消毒后即可使用。十一、试剂一定要用口己的。因为并不是每个人的操作都规范，因此相互之间串着用，很容易造成交

5、叉污染。十二、一次将所有的所需要试剂、工具放入工作台。不要在实验室中途，又出工作间去拿东西，这样增加了污染的机会。十三、整个操作耍快、动作耍轻、而且不耍处理其他的事情。比如手机响了，最好不要接。最好操作的时候将手机关机。十四、一般开紫外线照射台的吋候，就将培养基、酶、DHANKS液置于室外让其自然升温。这样40inin后，温度也升上来了。有很多人将其放到37°C水浴锅里加热。一定耍注意水浴锅的卫生，有的常年不清洗，里而很脏，容易在外面瓶身上吸附大量细菌。因此使用时一定要勤换水。从水浴锅取出后，最好用毛巾擦干上面的水。十五、操作前要洗手，用75%酒精擦手。用完操作台，要打扫卫生。十六、

6、对于培养条件要求较高的细胞，一般都是第一天处理完后,加少量培养基（能够盖住瓶底部），第二天换液，以免死细胞和碎片对活的细胞产生不良影响。十七、按照试剂的保存标准保存，例如血清、胰酶等没开封的・20°C保存，开封后・4°C保存一般不超过7天。