免疫荧光技术2.doc

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1、荧光免疫染色和DAPI染色实验1.实验原理免疫染色的实验原理类似于WesternBlotting,两者都是运用抗体的特异性识别作用来显示目的蛋白，但是山于免疫染色需耍在原位进行，而且蛋白没有经过富集，因此英实验难度较高。实验的基本原理是：利用固定剂（通常是甲醛或多聚甲醛）将细胞固定，使得细胞膜的通透性大大增加，并且利用Triton-X-100使得一部分膜蛋白变性，从而使通透性进一步加强。利用止帘羊血清封闭，可以令许多蛋白先与血清内的非特异性抗体结合，I佃特并性的抗体山于动力学的关系可以通过竞争性的反应与目的蛋白结合，这一过程可以保证抗体识别的特异性。二抗可以特异性识别一抗的Fc区域

2、，利用二抗连接不同的荧光基团，就可以在荧光艶微镜下观察到不同的荧光，从而显示目的基因的农达情况。另外，免疫荧光实验山于英较高的敏感性可以昭示出基因表达的亚细胞情况（核内，核外，膜上以及一些较大的细胞器上）,所以通朋被用来作为基因定位的方法。DAPI的中文名称是46-联月米・2-苯基口引味，是一种常用的荧光染料，其作用机理与混化乙锭(EB)等染色剂的机理类似：它们与DNA双螺旋的凹槽部分可以发生相互作用，从而与DNA的双链紧密结合。结合后产生的荧光基团的吸收峰是358nm而散射峰是461nm,止好UV(紫外光)的激发波长是356nm9使得DAP1成为了一-种常用的荧光检测信号。Jag

3、ielskiM.et.Al在1976年首次运用该技术检测细胞培养中的支原体感染。后來随着技术的进步，该技术被运用于各种微生物的检测、生长监测,胚胎发育过程的检测，细胞周期的检测和备种核定位的实验。本实验就是利用DAPI染色标记细胞核的位置。免疫染色实验方法和步骤免疫染色(immunolstaining)包括免疫荧光(immunolfluorescence)、免疫纽化(immunolhistochemistry)、免疫细胞化学(immunolcytochemistry)等，可以参考如下步骤进行操作。1.样品准备(Samplepreparation)对于贴舉细胞：可以直接用多孔板，例如

4、6孔板、24孔板等，培养细胞，然后到预定时间吋进行固定等后续操作。也可以用洁净的盖玻片，70%乙醇中浸泡后，用无菌的银了放置到6孔板内，然后用无菌的生理盐水、PBS或培养液洗去残留的乙醇。这时就可以种入细胞进行培养，待细胞贴在盖玻片上生长良好后，叩可进行固定等后续操作。对丁悬浮细胞:把细胞先在固定液屮固定，然后把细胞滴加在载玻片上，干燥后细胞会紧贴在载玻片上。然后就可以进行后续操作。如果细胞的粘附能力不佳,可以在载玻片上用PDL等物质进行处理，以增强载玻片的粘附能力。对于冷冻切片:FrozenSections切片放置在载玻片上后，可以直接进行固定等后续操作。对于石蜡切片:paraf

5、finsection脱蜡：切片在二甲苯中脱蜡5分钟，再换用新鲜的二甲苯脱蜡，共用二甲苯脱蜡3次。无水乙醇5分钟，两次。90%乙醇5分钟，两次，70%乙醇5分钟,一次。蒸绸水5分钟，两次。抗原修复：根据不同的抗原和抗体，可以选择把切片放直在如下抗原修复液中，lOmM柠檬酸钠，pH6.09或ImMEDTA9pH8.09或lOmMTris,pH10.0995°C加热12分钟，大约在30分钟内缓慢冷却至室温。2.固定可以使用适当的固定液固定细胞或切片，例如碧云天生产的免疫染色固定液(P(X)98)。固定完毕后，可以用免疫染色洗涤液(P0106)洗涤两次，每次5分钟。3.封闭(Blockin

6、g)加入免疫染色封闭液(P0102),封闭60分钟。如果背景较高，可以4°C封闭过夜。从封闭开始所有的步骤，一定要注意样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景。在整个免疫染色过程中我们推荐使用碧云天的侧摆摇床(ESHK02)，侧向摆动速度比较缓慢，而且也容易让溶液覆盖样品。如果样品比较容易脱落，也可以把所有的步骤放置在桌面上静止进行，即封闭、抗体卿育、洗涤等步骤均不需摇动，但静止操作时宜适当延长作用时间或次数。4.一•抗孵育(Primaryantibodyincubation)参考一抗的说明书，按照适当比例用免疫染色一抗稀释液(P0103)稀释一•抗n用微型台式真空泵(E

7、VAC06/EVAC07)吸尽封闭液，立即加入稀释好的一抗，室温或4°C在侧摆摇床上缓慢摇动孵育-小时。如果一抗孵育一小时效果不佳，可以4°C缓慢摇动孵育过夜。冋收一抗。加入免疫染色洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高对以适为延长洗涤时间并增加洗涤次数。5.二抗孵育(Secondaryantibodyinucubation)参考二抗的说明书，按照适当比例用免疫荧光染色二抗稀释液(P0108)稀释荧