免疫荧光技术交流

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1、免疫荧光（所有的步骤仅为个人意见,仅供参考）M切片完成之后开始免疫实验荧光器材避光场所，湿盒，烘箱等加温设备，吸水的纸，移液枪，1.5mlEP管，微波炉，抗原修复用的容器，ph试纸或ph仪，盖玻片，多聚赖氨酸包被的载玻片等免疫荧光实验试剂一抗荧光二抗Hoechst33342（与双链DNA结合，显核，蓝荧光）抗体稀释液（含WBSA的PBS）10XPBS（NaCl42.5g,NaII2P04•2H201.482g,Na2HP04•12H2014.5055g,定容至500ml，酉己完最好高压灭菌一下）。PBS（10XPBS稀释10倍，再调ph至7.2

2、-7.4。用得可快了）。10X拧檬酸盐抗原修复液（C6H8O7*H2O2g，Na3C6H507•2H2011.8g，定容至500ml，配完最好高压灭菌一下）。柠檬酸盐抗原修复液（10X柠檬酸盐抗原修复液稀释10倍，再调ph至6.0）。封片剂（0.672gNaIIC03加40ml蒸溜水（其为0.2mol/L），以lmol/L的NaOH调其ph至9.0左右（NaOH加0.75ml左右吧）。吸取lml此液体，与lml100%甘油混匀即可）蒸馏水免疫荧光程序：包埋好的标木用切片机切石蜡切片（2微米），并将蜡片贴附于多聚赖氨酸处理过的载玻片上（可购买，我

3、用的是北京中衫的，从不掉片）。经60°C烘片2-8小时（都试过，没啥差别，但非实质性器官应适当延长时间）。二甲苯I脱蜡4分钟（若要保证脱蜡完全可将其加热至40-60°C）,二甲苯II脱蜡6分钟。梯度酒精复水：100%酒精1分钟，95%酒精1分钊•，75%酒精1分钊！（这个梯度是没问题的，而且都是现成的医用酒精，不用配制），蒸馏水2分钟，PBS2分钟X2次。进行抗原修复：将切片置于0.lmol/L且ph-6.0的枸橼酸液修复液中，用微波炉中火加热6分钟至微微沸腾，再用中低火力维持10分钟，停止加热后自然冷却20-30分钟（我想还是煮沸6分钟X4次

4、更好）。PBS浸洗2分钟后滴加0.3%tritonX-100透膜剂透膜12分钟（不透膜也没关系，反正细胞早就被切开了）。但注意细胞膜表而的整合蛋白不能加tritonX-100，否则会被洗掉。用PBS2分钟X2次洗去透膜液，用滤纸擦去标本外的PBS，滴加封闭血淸（无色的10%FBS或免疫组化试剂盒北京中杉中的封闭液）在湿盒屮37°C封闭30分钟（室温30分钟也可）。用滤纸擦去封闭液，勿洗。滴加适宜浓度的一抗置湿盒中rc孵育过夜（37°C1小时多也差不多），再用PBS3分钟X5次洗去一抗，用滤纸擦去标本外的PBS。滴加荧光二抗室温置湿盒屮避光孵育1

5、-1.5小时，此时可在荧光显微镜T迅速观察是否着染，以确定终止时间。用PBS3分钟X3次洗去二抗，用滤纸擦去标本外的PBS。滴加Hoechst33342避光孵育2分钟，可对标本进行显核，蓝色荧光，效果极佳。用PBS1分钟X3次洗去Hoechst33342,用滤纸擦去标本外的PBS。最后用含抗荧光淬灭剂的封片液碧云天封片（可自配），并在荧光显微镜下立即观察。照相后可用Photoshop将同一视野下不同的荧光图像叠加，效果不错，有一篇参考文献支持。▲注：若一张切片同时做两种抗体的免疫焚光，则加一抗时可将两种一抗按各自所需的浓度混合，但要注意抗体要来

6、源于不同的动物。加二抗时也可将两种二抗按各自所需的浓度混合，但要注意二抗要有不同的颜色。1直接免疫荧光法的操作步骤标本的处理：石蜡切片经脱蜡、梯度洒精脱水后，进行抗原修16然后用0.01MPBST漂洗5minx3/次；•2%BSA或10%BSA37C湿盒内封闭30min•抗体染色：-C孵育30min:°在标本片上滴加适当稀释的荧光标记抗体（1:8或1:16稀释），放在湿盒中，37•O.OImol/LPBS（pH7.4）漂洗5minx3/次，不吋震荡（洗去多余游离的荧光素标记的抗体）。•缓冲甘汕封片-分析纯无荧光的甘汕9份+pH9.2,0.2M碳

7、酸盐缓冲液1份配制。•镜检：在荧光显微镜下观察。•优点：方法简便、特异性高，非特异性焚光染色少。•缺点：敏感性偏低；而i每检查一种抗原就需耍制备一种荧光抗体。若检测多种抗原盂制备多种相应的荧光标记抗体。直接免疫荧光法的注意事项p•对焚光标记的抗体的稀释：要保证抗体的蛋白有-•定的浓度；•一般稀释度不应超过1:20,抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。•染色温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化：-染色时间：从10min到数小时，一般30min:-C的低温，延长染色吋间。°C可加强染色效果，但对不耐热的抗原（如流行性乙型脑炎

8、病毒）可采川0-2°C）,髙于37°染色温度：多采用室温（25-C30min效果好的多。°低温染色过夜较37•试验时需设罝下列对照：-自发荧光对照（空