免疫荧光染色sop

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1、解放军肾脏病研究所重点实验室免疫荧光组作业指导书文件编号：NZ-RION-SYS-SOP版本/修订号：A/01主题内容免疫荧光染色修订日期：20111201第7页共7页肾活检冰冻切片免疫荧光染色（直接法）一．试剂1.冷冻包埋剂OCT2.荧光抗体：　IgG-FITC（1：100），IgA-FITC（1：200），IgM-FITC（1：300），C3-FITC（1：100），C1q-FITC（1：150）3.PBS：欧蒙公司试剂盒中附带。（PH值为7.2）4.封片甘油：欧蒙公司试剂盒中附带。（PH值为8.4）二

2、．取材1.准备液氮罐、冷冻架、塑料小凹、OCT2.活检标本取出后，立即浸入塑料小凹OCT中，置液氮罐内冷冻架上速冻约10秒3.置恒冷切片机内立即行冰冻切片（切片厚度为3um）三、固定1.待冰冻切片充分干燥后，立即放入纯丙酮固定7min，吹干，收至低温冰箱保存。2.固定后的冰冻切片已干燥，可直接染色，如从低温冰箱取出的冰冻切片，须充分吹干，方可染色。四、抗原抗体反应过程1.IgG,C3加一抗前用TBS孵育15min，IgA，IgM，C1q加一抗前用10%小牛血清封闭15min。（10%小牛血清为PBS稀释）2

3、.去除多余液体，加稀释好的抗体，避光，湿盒内室温孵育40min解放军肾脏病研究所重点实验室免疫荧光组作业指导书文件编号：NZ-RION-SYS-SOP版本/修订号：A/01主题内容免疫荧光染色修订日期：20111201第7页共7页3.流水冲洗，置95%酒精2min，吹干4.甘油封片，荧光显微镜观察结果五、注意事项1.冷冻标本时间要掌握好，防止过软或碎裂2.切片温度需适宜，不宜过高或过低3.染色过程中必须防止切片干燥，严格避光4.多聚赖氨酸、丙酮、酒精、缓冲液必须及时定期更换肾活检石蜡切片免疫荧光染色（间接法

4、）一、试剂一抗：IgG（1：50）IgA（1：50）IgM（1：50）C3（1：50）　C1q（1：50）以上均为DAKO公司产品1.二抗猪抗兔-FITC（1：50，DAKO公司）2.EDTA(PH=8.0)3.胃蛋白酶（Invitrogen）4.PBS：欧蒙公司试剂盒中附带。（PH值为7.2）5.封片甘油：欧蒙公司试剂盒中附带。（PH值为8.4）二、方法1.光镜石蜡切片脱蜡、入水2.用高温高压修复15min(EDTA,PH=8.0)，冷却后水洗3.胃蛋白酶室温消化5min，水洗4.10%小牛血清封闭（10

5、%小牛血清为PBS稀释）5.去除多余液体，加稀释好的抗体后，避光，室温或4度过夜解放军肾脏病研究所重点实验室免疫荧光组作业指导书文件编号：NZ-RION-SYS-SOP版本/修订号：A/01主题内容免疫荧光染色修订日期：20111201第7页共7页1.PBS冲洗2min。2.加SAR-FITC，避光，置室温40min，水洗3.吹干，甘油封片，荧光显微镜观察结果三、注意事项1.脱蜡后，整个染色过程必须防止切片干燥，严格避光2.染色后如切片不立即观察，需置低温避光保存3.PBS必须每次新鲜配制肾活检冰冻切片免疫

6、荧光染色（间接法）一、试剂1.一抗：C4d（1：50）A/P蛋白（1：50）HBeAg（1：200）HBcAg（1：400）HBsAg（1：100）κ链、λ链（1：100）ColIII（1：2000）IgG亚型（1：200）（DAKO公司）2.二抗：猪抗兔抗体-FITC、兔抗鼠抗体-FITC1：50（DAKO公司）二.方法1.冰冻切片如已干燥，可直接染色（如从低温冰箱取出的冰冻切片，须充分吹干）2.10%小牛血清封闭（10%小牛血清为PBS稀释）解放军肾脏病研究所重点实验室免疫荧光组作业指导书文件编号：NZ

7、-RION-SYS-SOP版本/修订号：A/01主题内容免疫荧光染色修订日期：20111201第7页共7页1.去除多余液体，加稀释好的抗体后，避光，室温孵育1.5小时2.PBS冲洗2min，3.加SAR-FITC或RAM-FITC，避光，置室温40min，水洗4.吹干，甘油封片，荧光显微镜观察结果三.注意事项1.取材后标本须立即速冻2.切片温度需适宜，不宜过高或过低3.染色过程中必须防止切片干燥，严格避光，4.乙肝染色要设阴性对照。Cola3（1：50）染色方法1.冰冻切片如已干燥，可直接染色（如从低温冰箱

8、取出的冰冻切片，须充分吹干）2.10%小牛血清封闭10min（10%小牛血清为PBS稀释）3.去除多余液体，加稀释好的Cola3（1：50）抗体后，避光，室温孵育2h，4.PBS冲洗，5.加RAM-FITC，避光，置室温40min，水洗6.吹干，甘油封片，荧光显微镜观察结果解放军肾脏病研究所重点实验室免疫荧光组作业指导书文件编号：NZ-RION-SYS-SOP版本/修订号：A/01主题内容免疫荧光染色修订日期：2