免疫荧光技术.doc

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1、免疫荧光技术免疫荧光技术基本原理：免疫荧光技术是根据抗原抗体反应的原理，先将己知的抗原或抗体标记上荧光索，制成荧光抗体，再用这种荧光抗体(或抗原)作为探针检测纽•织或细胞内的相应抗原(或抗体)。在组织或细胞内形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光索，利用荧光显微镜观察标本，荧光索受外来激发光的照射而发生明亮的荧光(黄绿色或橘红色)，可以看见荧光所在的组织细胞，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。应用范帅其应用范I羽极其广泛，可以测定内分泌激索、蛋白质、多肽、核酸、神经递质、受体、细

2、胞因子、细胞表面抗原、肿瘤标志物、血药浓度等各种生物活性物质。根据诊断类别，又可分为传染性疾病、内分泌、肿瘤、药物检测、免疫学、血型鉴定等。常见荧光色索：许多物质都可产生荧光现彖，但并非都可用作荧光色索。只冇那些能产生明显的荧光并能作为染料使用的有机化合物才能称为免疫荧光色素或荧光染料。常用的荧光色素有：(-)荧光色素1.异硫瓠酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate,FITC)为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水或酒精等溶剂。分子量为389.4,最大吸收光波长为490495m,最大发

3、射光波长520530nm，呈现明亮的黄绿色荧光，结构式如卜I有两种同分异结构，其中异构体I型在效率、稳定性、与蛋白质结合能力等方面都更好，在冷暗干燥处可保存多年，是应用最广泛的荧光素。其主要优点是：①人眼对黄绿色较为敏感，②通常切片标木中的绿色荧光少于红色。2.四乙基罗丹明(rhodamine,RTB200)为橘红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮。性质稳定，可长期保存。结构式如下：最大吸收光波长为570nm,最大发射光波长为595〜600nm,呈橘红色荧光。3.四甲基异硫竄酸罗丹明(tetramet

4、hylrhodamineisothiocyanate,TRITC)结构式女IIT：最大吸引光波长为550nm,最大发射光波长为620nm,呈橙红色荧光。与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色。其异硫氤基可与蛋白质结合，但荧光效率较低。(二)其他荧光物质1.酶作用后产生荧光的物质某些化合物本身无荧光效应，一口经酶作用便形成具冇强荧光的物质。例如4-甲基伞酮-B-D半乳糖苗受B-半乳糖葫酚的作用分解成4-甲基伞酮，后者可发出荧光，1激发光波长为360nm,发射光波长为450nmo其他

5、如碱性酸酶的底物4-甲基伞酮磷酸盐和辣根过氧化物酶的底物对轻基苯乙酸等。1.斓系螯合物某些3价稀土斓系元索如钳（Eu3+）、铺（Tb3+）、鋪（Ce3+）等的螯合物经激发后也可发射特征性的荧光，其中以Eu3+应用最广。Eu3+螯合物的激发光波长范围宽，发射光波长范围窄，荧光衰变时间长，最适合用于分辨荧光免疫测定。所需要的仪器：荧光显微镜、显微荧光分光光度计、流式细胞仪和时间分辨荧光计等仪器激光共聚焦显微镜荧光偏振免疫分析用偏振光激发标记物，利用结介竞争免疫原理，可以快速检测激索种瘤标志物、维生索和多种

6、治疗药物浓度。而且用于鉴定的材料也比较多样，可以是培养物、感染组织、分泌排泄物，也可以是土壤、水、杂物等。应用于生物酶含量及活性测定、临床医学检验、食品分析和环境监测、毒品检验。一、时间分辨荧光免疫测定以常用荧光索作为标记物的荧光免疫测定往往受血清成分、试管、仪器组件筹的本底荧光干扰，以及激发光源的杂射光的影响，使灵敏度受到很大限制。时间分辨荧光免疫测定（timeresolvedfluorescenceimmunoassay,TR-FTA）是针对这缺点加以改进的一种新型检测技术。其基本原理是以鋼系元索

7、钳（Eu）螯合物作荧光标记物，利用这类荧光物质冇长荧光寿命的特点，延长荧光测量时间，待短寿命的自然本底荧光完全衰退后再行测定，所得信号完全为长寿命飼系螯合物的荧光，从而有效地消除非特异性木底荧光的干扰。TR-FIA的测定原理见图17-4o以双抗体夹心法为例的测定反应程序见图17-5o其屮增强液的作用是使荧光信号增强。因为免疫反应完成后，生成的抗原一抗体一钮标记物复合物在弱碱性溶液中，经激发后所产生的荧光信号冥弱。在增强液中可至pH2〜3,钳离子很容易解离出来，并与增强液中的B-二酗体生成带有强烈荧光的

8、新的钳螯合物，大大有利于荧光测量。所用检测仪器为时间分辨荧光计，与一般的荧光分光光度计不同，采用脉冲光源（每秒闪烁1000次的氟灯），照射样品后即短暂熄灭，以电子设备控制延缓时间，待非特异本底荧光衰退后，再测定样品发出的长鋼系荧光。检测灵敏度可达0.2〜Ing/mlo解离增强澜系元素荧光免疫分析（DissociationEnhancedLanthanideFluoroimmunoassayDELFIA）是时间分辨荧光免疫分析中的一种。它用具有双功能基团结