项目十一免疫荧光技术

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1、项目H、一免疫荧光技术抗核抗体检测(Fluorescentantinuclearantibodyassay)【实验原理】抗dsDNA抗体是常见的抗核抗体之一，常用间接災光抗体染色技术进行检测。选择马購疫锥虫(Trypanosomaequiperdum，TE)作抗原基质片足因其胞核及动基体不含组蛋Cj，为纯的双链DNA,抗原纯，特异性高。将待检血清滴于其上，如血淸内含抗dsDNA抗体，则与TE什的dsDNA结合，在加入异硫瓿酸災光素(FITC)标记的抗人lg抗体后，在荧光显微镜下可见到TE动基体和

2、细胞核呈现亮绿色荧光。【试剂和器材】1.标本待检血清、阳性和阴性对照血清、市售或A制TE抗原片。2.试剂FITC标记的抗人IgG抗体、pH7.40.01mol/LPBS、pH8.0缓冲甘汕(取9份甘油加1份PBS混匀)。3.器材荧光敁微镜、水浴箱或温箱、湿盆、染色缸、盖玻片、吸管、滴管、试管等。4.动物小白鼠。【方法和步骤】1.TE抗原片的制备将TE感染小G鼠,2〜4F1后取小fl鼠外周血按WBC计数法作TE计数，达(4.3〜5.6)xl06时采鼠尾血涂片，自然十燥后直接应用或冰箱保存(保存期3

3、个月)。2.间接免疫荧光染色(1)取出TE抗原片，加少许蒸馏水作川30〜60s以溶解鼠红细胞，晾干。(2)将待检血清和对照血清用PBS作U0稀释，滴加于抗原片上，放湿盒内置37"C作用30min。(3)取出抗原片，放入盛右PBS的3个染色缸内依次浸洗，每缸5〜lOmin，吹干。(4)滴加适当稀释的荧光抗体，同上温育30min。(5)按步骤(3)洗片，吹干。⑹滴加缓冲甘汕封片，荧光显微镜下观察。【结果判定】1.每高倍视野中有2/3虫体的动基体和胞核呈亮绿色荧光者为k'M性。TE核大，动基体小，呈岡

4、或椭岡形，成对出现，虫体轮廓隐约可见。阳性血淸应进一步连续稀释，以确定抗体效价。2.正常人为抗dsDNA阴性。阳性血清抗体效价在1:10以上时有诊断意义。【注意事项】1.TE抗原片应及时使用或低溫妥善保存。2.涂片不宜太厚，用时需用蒸馏水处理。3.洗涤要彻底，避免非特异性染色。4.待检血清应新鲜或-20'C保存旦无细菌污染。【方法评价】1.与放免及酶免疫检测相比，木方法迅然敏感性稍低，但特异性商，操作简便，故最为常用。2.使川TE抗原片，非特异性染色低，观察结果淸晰可靠。【临床意义】1.抗dsD

5、NA是SLE的特征性身抗体，阳性率为40%〜60%,主要见于SLE活动期或SLE合并肾炎的患者，少见于其他风湿病如RA等。2.抗dsDNA的检测可动态观察SLE的活动，观察疗效及判断预后。3.抗dsDNA抗体的存在常形成免疫复合物，引起III型变态反应，导致红斑狼疮性行炎。【附】荧光素标记抗体的制备(一)透析标记法1.试剂(1)FITC。(2)CB(pH9.40.025mol/L)Na2CO3().53gNaHCO31.68g加蒸榴水至1000mlc(3)PBS(pH7.4O.Olmol/L)2

6、.标记(1)用CB将Ig溶液蛋白质浓度调至10mg/ml,并裝入透析袋。(2)収10倍Ig溶液量的CB,加入FITC使终浓度为0.1mg/mh(3)将透析袋浸没于F1TC液中，于4°C搅拌24h。慢速搅拌，勿起泡沫。(4)川PBS透析5〜7大，或过SephadexG-25柱以去除游离的荧光素。(5)加入0.卜O.2g/L硫柳汞或1.()〜l().()g/LNaN3,小撒分装，置4°C或-20°C侃存(不可反复冻融)，真空冷冻干燥后保存效果会更好。(二)直接标记法1.试剂(1)FITC(2)CB(

7、pH9.50.5mol/L)Na2CO32.94gNaHCO31.59g加蒸榴水至100ml。(3)PBS(pH7.20.005mol/L)Na2HPO4.12H2O1.29gNaH2PO4.2H2O0.22gNaCl(0.1mol/L)5.84g加蒸榴水至lOOOmU2.标记(1)用生:理盐水将lg溶液蛋白质浓度调至20mg/mlo(2)取1/10Ig溶液量的CB，加入FITC,加入量为Ig含量的1/100〜1/150(终浓度为0.13〜0.20mg/ml)。(3)磁力搅拌，逐滴加入FITC。

8、加完后移至4°C继续搅拌6〜12h(7〜9°C需4h，20〜25°C需1〜2h)。应注意测定溶液pH,若降低可川0.2mol/LNa2CO3调至9.0〜9.5。(4)将标记溶液流水透析5min，再用大鲎PBS4°C透析4h。一般PBS滅:为标记物的100倍。⑶过PBS已经平衡好的SephadexG-25柱，上样量应小于床体积的1/2。用PBS洗脱，收集第1若色峰即为荧光抗体。(1)保存同透析标记法。【思考题】1.TE抗原片有哪些优点？2.常见的荧光抗体染色方法奋哪些类型?