细菌的培养及鉴定.ppt

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1、细菌培养及鉴定标本采集原则1.及时采集微生物标本作病原学检查2.在抗菌药物使用前采集标本3.采样时严格执行无菌操作4.标本容器须无菌，但不得有消毒剂5.采样后立即送检6.送检标本应注明来源和检验目的咳痰方法病人先漱口，清洁口腔，去除表面的菌群病人深咳，收集从下呼吸道咳出的痰液无痰可用3％～5％NaCl5ml雾吸约5min导痰以清晨第二口痰为佳标本采集后放置时间不超过2小时清洁中段尿液尽量取早晨第一次尿液嘱患者留取标本的前一天晚上少饮水女性病人收集标本前用肥皂水冲洗外阴，再以灭菌清水冲洗尿道口排出几毫升后，不停止尿流，采集中段尿男性病人翻转包皮，清洗尿道口排出几毫升后，不停止尿流,采集中段尿

2、采集标本后立即送检！哥伦比亚血平板—营养要求高的细菌巧克力平板—含V、X因子，主要培养嗜血杆菌、脑膜炎球菌和淋球菌用中国蓝/麦康凯平板—G-杆菌用SS平板—沙门氏菌和志贺氏菌用M-H平板—细菌药敏用TCBS平板—弧菌科细菌用沙包氏平板—真菌培养用真菌显色平板—真菌培养用罗氏培养基—分枝杆菌用常用的培养基种类和用途临床标本培养基选择血：血培养瓶中断尿：血平板、mac平板脑脊液：血培养瓶、血平板、巧克力平板穿刺液：血培养瓶、血平板、巧克力平板、mac平板胆汁：血平板、巧克力平板、mac平板大便:.麦康凯、SS、血平板细菌接种的基本程序灭菌接种环沾取标本接种灭菌接种环细菌接种法平板划线接种法：★

3、目的：使混合的细菌呈单个分散生长，形成单个菌落，以便获得纯菌。★方法：★分区划线法：适用于含菌量较多的标本★连续划线法：适用于含菌量较少的标本分区划线法(3区)第一区划线灭菌接种环第二区划线灭菌接种环第三区划线灭菌接种环连续划线法细菌培养法一般培养（需氧培养）：★培养温度：35℃（采用恒温培养箱）★培养时间：18～24h二氧化碳培养法：烛缸法、二氧化碳培养箱厌氧培养法：厌氧培养箱、厌氧袋、厌氧罐、疱肉培养法、硫乙醇酸盐法等细菌在固体培养基中的生长现象菌落★定义：指单个细菌在平板培养基上生长繁殖，形成单一肉眼可见的细菌集团。★菌落特征：大小、形状、边缘、颜色、表面、透明度、湿润度、黏度、溶血

4、性★菌落类型：光滑型（S）、粗糙型（R）、黏液型（M）菌苔：指多个菌落融合在一起形成的细菌堆积物。菌落菌落与菌苔菌落的三个类型：1.光滑型菌落（SmoothtypeColony）：又称S型2.粗糙型菌落（RoughtypeColony）：又称R型3.粘液型菌落（MucoidtypeColony）又称M型2021/7/2116S型菌落R型菌落M型菌落革兰染色原理：通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，，因此能把

5、结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经复红等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。革兰染色步骤涂片包括涂片、干燥、固定三步。涂片干燥固定固定的目的：使细菌的细胞凝固，使菌体与玻片粘得更牢固；可改变菌体对染料的通透性；加热固定可杀死细菌，比较安全。结晶紫1’碘液1’95%乙醇30”复红1’冲洗滤纸干燥油镜观察冲洗冲洗冲洗革兰染色程序初染媒染脱色复染紫色（G＋）革兰氏染色步骤示意图革兰染色甲菌乙菌初染

6、结晶紫媒染碘液脱色乙醇复染稀释复红紫色（G＋）红色（G-）革兰染色步骤示意图【结果】细菌被染成紫色者，称为革兰阳性菌；而细菌染成红色者，称为革兰阴性菌；阳性菌——紫色（G+b)阴性菌——红色（G-b)G+球菌显微镜下的杆菌G-杆菌Figure2-GramstainofGram-E.colicells痰标本涂片染色低倍镜下分类分级白细胞（个）上皮细胞（个）A>25<10B>25<25C<10>25A、B两种情况的痰适合做培养，C不合格，应重新留标本革兰染色注意事项标本涂片不宜太厚固定不宜过热脱色不宜过度选用培养18--24小时菌龄的细菌为宜抗酸染色原理：分枝杆菌细胞壁含脂质较多,其中主要成分

7、为分枝菌酸,此物具有抗酸性,染色时与石炭酸复红结合牢固,能抵抗酸性乙醇的脱色作用,因此抗酸菌能保持复红的颜色,达到染色目的。抗酸染色步骤1、涂片包括涂片、干燥、固定三步。涂片干燥固定抗酸染色步骤2、染色包括初染、脱色、复染三步。石炭酸复红维持3-5’3%盐酸酒精30’’~1’美蓝复染1’冲洗干燥油镜观察冲洗冲洗初染脱色复染抗酸染色结果抗酸菌呈红色，常堆积成团，排列无序，偶呈分枝状生长。背景及非抗酸性细菌呈兰色。抗酸杆菌报