细菌培养基的制作培养和鉴定

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1、细菌培养基的制作及细菌的培养和鉴定（杭州师范大学临床医学09级）［摘要］:目的：掌握细菌的细菌的培养基制作、高压蒸汽灭菌法的使用、细菌的接种法（无菌操作技术）、细菌的形态学检查法、细菌的培养物观察、肠道杆菌的生化反应、分离与鉴定模拟粪便7种生化反应结果观察、细菌的药敏试验、紫外线杀菌试验等一些基本的实验操作。培养基;SS培养基;EMB平板;药敏试验;细菌培养基的制作及细菌的培养和鉴定是我们做微生物实验的基础，细菌培养基的制作，高压蒸汽灭菌法的使用、细菌的接种法（无菌操作技术）、细菌的形态学检查法

2、、细菌的培养物观察、肠道杆菌的生化反应、分离与鉴定模拟粪便7种生化反应结果观察、细菌的药敏试验、紫外线杀菌试验等一系列实验都是基本的微生物实验操作，掌握这些基本技巧对微生物的实验研究有着至关重要的地位，培养基是细胞生长的基础，高压蒸汽灭菌保证了培养基的绝对灭菌，细菌的形态学检查可以区别有无鞭毛，7种生化反应结果观察可以区别不同的细菌。L细菌的培养基制作培养基是按微生物生长发育的需要，用不同组分的营养物质人工配制而成的营养基质。我组主要制作平板（大小平板）培养基的制作。1.1平普通板培养基：用途：

3、细菌的分离培养、药敏试验等配方：按试剂瓶（营养琼脂培养基）说明配制。操作：1.配制600ml1000ml的三角烧瓶一高压灭菌一倒30块大平板，约20ml/块。1.配制500mlX2=1000ml,分2瓶配制1000ml的三角烧瓶一高压灭菌一倒60块小平板，约15ml/块。图1：普通平板培养基1.2SS培养基:用途：用于沙门菌属、志贺氏菌的选择性分离培养。配方：肉膏汤琼脂100ml乳糖1克胆盐0.85克枸椽酸钠0.85克硫代硫酸钠0.85克10%枸椽酸铁水溶液1ml1%中性红水溶液0.25ml1%

4、煌绿水溶液0.033ml操作：除了煌绿、中性红以外，将其他各成分混合均匀，加热熔化，调ph至7.0,再加入煌绿和中性红，分装于三角烧瓶中，以68.95kpa高压灭菌10分钟，待冷至50°C左右，倾注于无菌平板中，冷后备用。:图2：SS培养基1・3伊红美兰琼脂培养基（EMB平板）用途：分离肠道杆菌常用的鉴别培养基。配方：蛋白栋10g磷酸氢二钾2g琼脂20g乳糖溶液（20%）50ml伊红溶液（2%）20ml美蓝溶液（0.5%）20ml蒸饰水1000ml操作：1.将蛋白栋和磷酸氢二钾加温熔化于蒸馄水中

5、2.校正ph值为7.6加入琼脂3.煮沸熔化过滤后分装三角瓶屮，每瓶定量分装4.15磅30min高压灭菌5.以无菌操作法按量加入经10磅20min高压灭菌的乳糖，伊红美蓝液，混匀后倾注拼平皿备用。图3：EMB平板2.细菌接种分别在平板分区划线接种混合菌；SS平板、EMB平板接种（平板分区划线接种法）模拟粪便（大肠杆菌和乙型副伤寒杆菌混合菌）；斜面培养皐接种大肠、金黄色葡萄球菌;半固体培养基的接种痢疾、大肠菌，液体培养基的接种法一枯草杆菌、大肠杆菌（2次）、乙型链球菌、金黄色葡萄球菌。3・细菌的形态

6、学检查3.1用革兰染色法鉴别痰液细菌步骤：収一张玻璃片，将痰液涂于玻璃片中，再对痰液进行G染色。G染色方法：①初染（结品紫）1分钟后水洗，②媒染（碘液）1分钟后水洗，③脱色（95%酒精）0.5分钟后水洗④复染（稀释复红）0.5分钟后水洗。之后用吸水纸将片子上的水吸干，显微镜油镜镜检。镜检结果蓝紫色为革兰阳性菌，红色为革兰阴性菌。3.2抗酸染色鉴别实验室模拟痰液步骤：取一张玻璃片，将痰液涂于玻璃片中，再对痰液进行抗酸染色。抗酸染色方法：石炭酸复红加温染色5分钟一水洗一3%盐酸酒精脱色0.5~1分钟

7、一水洗一碱性美兰复染1分钟一水洗一吸水纸吸干一油镜镜检。镜检结果红色抗酸阳性/抗酸菌，蓝色抗酸阴性/非抗酸菌。3・3细菌的培养物观察模拟粪便接种在SS平板、EMB平板菌落图4：SS平板（模拟粪便）单个大肠杆菌菌落单个至病菌落:图5：EMB平板（模拟粪便）4.模拟粪便7种生化反应结果观察4.1步骤分别挑取分别挑収分离到的两种菌落，分别接种于1.双糖铁培养基，2.衙萄糖微量发酵管，3.乳糖发酵微量发酵管，4.尿素酶试验微量发酵管，5.H2S试验微量发酵管1.靛棊质试验蛋白月东水液体培养皋，7.动力试

8、验半固体培养基一天后观察实验结4.2实验结果:图6：双糖铁试验双糖铁试验结果表明：双糖铁试验上层为乳糖,下层为葡萄糖。可知致病菌（右）乳糖试验不产酸，下层葡萄糖试验产酸不产汽，菲致病菌（左）乳糖试验产酸，下层衙萄糖试验产酸产汽。说明致病菌不能分解乳糖，而能分解葡萄糖但是不能产生气体，非致病菌能分解乳糖产酸，但是是否有产生气体不能确定，非致病菌还能分解葡萄糖产酸产气。图7：4种微量发酵管试验图&靛基质试验1.葡萄糖发酵管中可见非致病菌（左）产酸产气，致病菌（右）产酸不产气。说明非致病菌分解葡萄糖并